肝类器官组合物以及其制备和使用方法技术

公开了诱导从如iPSC细胞等前体细胞形成肝类器官的方法。所公开的肝类器官可以用于筛选严重不良事件(SAE)，如肝衰竭和/或药物诱发的肝损伤(DILI)和/或药物毒性。所公开的肝类器官还可以用于治疗患有肝损害的个体或用于识别优选的治疗剂。

Liver organ composition and its preparation and use

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】肝类器官组合物以及其制备和使用方法相关申请的交叉引用本申请要求于2016年11月4日提交的美国临时专利申请62/471,371和2016年6月9日提交的美国临时专利申请62/517,414的优先权和权益，所述每个申请的内容通过引用以其整体并入用于所有目的。
技术介绍
肝是一种重要的器官，其为生命提供许多重要的代谢功能，如外源性化合物的解毒和凝血，以及产生脂质、蛋白质、铵和胆汁。体外重建患者的肝可以提供应用，包含再生疗法、药物发现和药物毒性研究。使用肝细胞的现有方法表现出极差的功能，主要是由于缺乏必要的解剖结构，这限制了它们在制药工业中的实际应用。由于初始筛选中识别的候选药物失败，每年因制药行业的药物开发而损失数十亿美元，并且近三分之一的药物因这种失败而退出市场(Takebe和Taniguchi，2014)。候选药物的失败导致患者治疗机会的巨大损失。临床前研究通常包括体外评估作为识别“命中”化合物的主要功效筛选，然后在体外和体内进行安全性研究以评估代谢和毒理学的机制。这种低效率可以解释为大量缺乏生理学相关的临床前模型，其在评估人类药物诱发的肝损伤(DILI)方面具有高通量，并且因此迫切需要开发用于评估大量的不断增长的化合物库的体外人工筛选模型。原代肝细胞是高度极化的代谢细胞类型，并形成具有微绒毛衬里通道的胆小管结构，将外周循环与胆汁酸分泌途径分开。DILI的最上游方面包含药物(或其活性代谢物)通过肝细胞解毒和通过转运蛋白如多药耐药相关蛋白(MRP)转运蛋白排泄到胆小管中。这表明需要重建这些独特组织的结构，作为体内肝细胞的关键特性，用于预测DILI病理学。然而，目前的简化培养模型与使用分离的原代人肝细胞或肝细胞系和体内生理学之间的药物毒性特征存在相当大的差异，导致药物翻译失败或停药，如曲格列酮、奈法唑酮和托卡朋的情况(https://livertox.nlm.nih.gov/index.html)。因此，毒理学特性的确定主要依赖于动物作为药物开发的必要步骤，然而，由于人类与动物之间生理学上的显著差异，人类结果显著缺乏忠诚度(Leslie等人，2007；Yang等人，2014)。此外，非常罕见但仍然导致美国约10％到15％的急性肝衰竭(Reuben等人，2010)的特异性DILI(IDILI)的发病几乎无法预测(Kullak-Ublick等人，2017)。总体而言，需要有效的人类细胞模型以筛选用于测试所提出的药物的解毒和排泄的化合物。尽管人类肝细胞分化方法从多能干细胞(PSC)逐步推进，但使用人类干细胞的培养皿中的临床试验仍然是“炒作”。[除药物筛选的功效和/或毒性外，还需要肝细胞模型例如，用于生物人工肝装置中作为移植的桥梁，并且用于精确(个性化医疗)。本公开旨在解决本领域中的上述需求中的一个或多个。
技术实现思路
公开了诱导从前体细胞，如iPSC细胞形成肝类器官的方法。所公开的肝类器官可以用于筛选严重不良事件(SAE)，如肝衰竭和/或药物诱发的肝损伤(DILI)和/或药物毒性。所公开的肝类器官还可以用于治疗患有肝损害的个体，或用于识别优选的治疗剂。附图说明本领域中的技术人员将理解，下面描述的附图仅用于说明性目的。附图不旨在以任何方式限制本教导的范围。专利或申请文件包含至少一幅彩色附图。具有一副或多副彩色附图的本专利或专利申请公开的副本将在请求并支付必要费用后由主管局提供。图1.从具有管腔结构的iPSC生成人肝类器官。A.用于肝类器官分化方法的概述。B.人肝类器官的相差图像。C.白蛋白(ALB)、IV型胶原(胶原蛋白IV)和ZO-1在类器官中的免疫染色。细胞核用苏木精(蓝色)染色。尺，50μm。D.未分化的iPS细胞，分化的第7天、第11天、第20天和第30天的类器官和原代肝细胞(PH)中甲胎蛋白(AFP)、白蛋白(ALB)、视黄醇结合蛋白4(RBP4)、细胞角蛋白19(CK19)、肝细胞核因子6(HNF6)和细胞色素P4503A4(CYP3A4)的定量RT-PCR。将相对表达值与未分化的iPSC(AFP、ALB、RBP4和CK19)或第7天的类器官(HNF6)或第11天的类器官(CYP3A4)进行比较。条形代表平均值±SD，n＝3。E.基于未分化iPS细胞(iPSC)、定形内胚层(DE)、肝特异性细胞(HS)、肝祖细胞(HP)、iPSC衍生胆管细胞(iDC)、正常人胆管细胞(NHC)、iPSC衍生的后部前肠(pFG)、iPSC衍生的人肝类器官、原代肝细胞、胎儿肝组织、肝组织和人肝的右叶中的RNA序列数据的主成分分析。F.第25天到第30天来自类器官的白蛋白(ALB，n＝10)和纤维蛋白原(FBG，n＝4)分泌水平。条形代表平均值±SEM。G.第25天到第30天来自类器官的补体因子分泌水平。FH：因子H、FB：因子B.条形代表平均值±SEM，n＝5。图2.人iPSC肝类器官中的胆汁酸合成、摄取和排泄。A.单个类器官中多药耐药相关蛋白2(MRP2)和胆汁盐输出泵(BSEP)的免疫染色。尺，50μm。B.示出微绒毛(V)腔内表面的类器官的透射电子显微照片；N:核。尺，10μm。C.未分化的iPSC、分化的第20天(NTCP)和第30天(ABCB11)类器官和原代肝细胞(PH)中ATP结合盒、亚家族B成员11(ABCB11)和牛磺胆酸钠共转运多肽(NTCP)的定量RT-PCR。将相对表达值与未分化的iPS细胞(ABCB11)或第11天的类器官(NTCP)进行比较。条形代表平均值±SD，n＝3。D.第27天类器官内的总胆汁酸分泌水平。条形代表平均值±SEM，n＝4。E.在荧光胆汁酸(CGamF)存在下培养30分钟之后，通过类器官摄取胆汁酸。F.衍生自4个iPSC系的类器官上的CLF转运活性。T、W、1和F表示iPS细胞系的克隆名称。绿色：CLF。图3.波生坦诱导的胆汁淤积特异于CYP2C9*2iPSC-肝类器官。A.在UGT1A1*6中的CYP2C9*2和rs4148323中的rs1799853的代表性等位基因图像分别示出波生坦和伊立替康的DILI风险SNP。表表明在每个iPS细胞系中具有风险等位基因。B.波生坦CLF转运活性和抑制的图像。C.衍生自不同4种iPS细胞系的各个类器官中的CLF强度水平。*：p<0.01，**：p<1E-4，****：p<1E-8，Wilcoxon-Mann-Whitney测试。NS：不重要。在框图中，框的顶部和底部代表第75和第25百分位数，中心线代表中位数。点表示来自每个类器官的数据。图4.使用类器官的高保真药物诱发的胆汁淤积模型。A.从类器官的外部到内部外排二乙酸荧光素的连续图像。B.二乙酸荧光素外排转运的比较。C.二乙酸荧光素外排转运到类器官的定量。实例左图是定量的类器官内部与外部之间的荧光强度的比率。右图表示使用对照(DMSO)、环孢菌素A(CSA)和链霉素(STP)作为阴性对照的验证研究的结果。条形代表平均值±SD，**：p<0.01,n＝4。D.处理9种训练化合物24小时之后二乙酸荧光素转运抑制的图像。E.训练化合物处理之后的转运抑制的定量，条形代表平均值±SD，*：p<0.05，**：P<0.01，n＝4到6。训练化合物处理之后的本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种诱导从iPSC细胞形成肝类器官的方法，其包括以下步骤：a)使衍生自所述iPSC细胞的定形内胚层(DE)与FGF途径激活剂和GSK3抑制剂接触足以形成后前肠球状体的时间段，优选地约1天到约3天的时间段；b)在视黄酸(RA)存在下培育步骤a的所述后前肠球状体足以形成所述肝类器官的时间段，优选地约1天到约5天的时间段，优选地约4天。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2016.11.04 US 62/417,371;2017.06.09 US 62/517,4141.一种诱导从iPSC细胞形成肝类器官的方法，其包括以下步骤：a)使衍生自所述iPSC细胞的定形内胚层(DE)与FGF途径激活剂和GSK3抑制剂接触足以形成后前肠球状体的时间段，优选地约1天到约3天的时间段；b)在视黄酸(RA)存在下培育步骤a的所述后前肠球状体足以形成所述肝类器官的时间段，优选地约1天到约5天的时间段，优选地约4天。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述干细胞是人iPSC。3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述前肠球状体嵌入基底膜基质，优选地基质胶中。4.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述HLO的特征在于所述HLO表达甲胎蛋白(AFP)、白蛋白(ALB)、视黄醇结合蛋白(RBP4)、细胞角蛋白19(CK19)、肝细胞核因子6(HNF6)、以及细胞色素P4503A4(CYP3A4)、HNF4a、E-钙粘蛋白、DAPI和Epcam，优选地当在第40天到第50天测量表达时。5.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述HLO的特征在于所述HLO具有胆汁转运活性。6.一种衍生自干细胞的肝类器官，其包括管腔结构，所述管腔结构包括内化微绒毛，所述内化微绒毛包括间充质细胞，其中所述管腔结构被极化的肝细胞和基底膜包围。7.根据权利要求6所述的肝类器官，其中所述干细胞是人iPSC。8.根据权利要求6或权利要求7所述的肝类器官，其中所述肝类器官包括功能性星状细胞和功能性库普弗细胞。9.根据权利要求6到8中任一项所述的肝类器官，其中所述肝类器官的特征在于，其具有以下中的一种或多种：胆汁产生能力、胆汁转运活性、至少50ng/mL/1xe6个细胞/24小时的补体因子H表达、至少40ng/mL/1xe6个细胞/24小时的补体因子B、至少1000ng/mL/1xe6个细胞/24小时的C3表达；至少1000ng/mL/1xe6个细胞/24小时的C4表达、至少1,000ng/mL/1xe6个细胞/24小时的纤维蛋白原产量以及至少1,000ng/mL/...

【专利技术属性】
技术研发人员：武部贵则，筱泽忠纮，木村昌树，小池博之，
申请(专利权)人：儿童医院医学中心，国立研究开发法人科学技术振兴机构，
类型：发明
国别省市：美国,US