一种组织学切片染色方法技术

本发明专利技术提供一种HE染色方法，包括(1)将生物组织切片、烘干、脱蜡，梯度酒精水化至水；(2)采用天青石蓝溶液浸泡；(3)采用苏木素染液染色；(4)水流冲洗至蓝化；(5)梯度酒精脱水；(6)采用伊红染液染色；(7)采用二甲苯透明；(8)封片。本发明专利技术苏木素染液体系中添加了乙酸，且苏木素染色经蓝化后，直接进行脱水步骤，至100％酒精后进行伊红染色，50％的醇溶液中滴加适量乙酸。通过该步骤创新，伊红染色调整到脱水步骤之后，保证脱水的梯度酒精无污染，使梯度酒精循环使用次数显著增加，大大降低了实验成本。并且调整后伊红染液的染色时间大幅度缩短，缩短了染色周期,染色的质量显著提高。

A staining method of histological sections

【技术实现步骤摘要】
一种组织学切片染色方法
本专利技术涉及医学生物形态学研究领域，具体涉及一种组织学染色方法，即苏木素伊红染色方法，简称HE染色。
技术介绍
HE染色技术目前是医学生物学领域应用最广泛的组织学染色方法，H指苏木精(hemaltoxylm)，E指伊红(Eosin)。染料的摄取常常是由于染料和组织之间的亲和力不同，而选择性的着色。亲和力受多种因素影响，如库伦引力，范德华力、氢键等，他们在时间和空间上影响着色效果。一般来说，苏木素将细胞核染成蓝黑色，而伊红将细胞质和大多数结缔组织纤维染成不同程度的红色。苏木素是由洋苏木(苏木素树的树心)经热水，尿素等工艺流程提炼而得，苏木素本身并不是一种染料，其主要氧化产物苏木红是一种天然染料，是该染料发挥功能的主要成分。苏木红可由苏木素通过自然氧化和化学氧化两种方法获得。自然氧化获得的苏木素染液染色能力可维持较长时间，但由于其生产周期长，在生物学领域应用较少。苏木素中功能成分苏木红是阴离子，若无媒介染剂，其对核的染色不会很充分，对组织的亲和力也较弱，因此根据苏木素中添加的媒染剂的不同，可分为：明矾苏木素、铁苏木素、钨苏木素、钼苏木素、铅苏木素和无媒染剂的苏木素。常规苏木素染液有Ehrlich、Mayer、Harris、Gill、Delafield和Cole，其中最常使用的是Mayer苏木素。伊红属于夹氧杂蒽类染料，市场上可见的伊红种类较多，但伊红Y实用最广泛。作为胞浆染料，最常与苏木素联用来显示常见的组织结构。HE染色的染色步骤分为两步，第一步为苏木素染色，第二部为伊红染色。其中苏木素染色根据苏木素种类的不同，可分为进行性染色和退行性染色。进行性染色是一次性达到核的着色效果，退行性染色是指先将组织切片过度染色，接着用酸性酒精分化，最后再反蓝。伊红的独特之处在于：适当分化后能染成不同程度的深浅不一的粉红至红色，便于区分不同类型的细胞的胞浆以及不同类型的结缔组织和基质。医学及生物学实验中，获取目的组织后，大都选择在福尔马林或布氏固定液中固定，然后实用酒精保存。对于某种特定的物质而言，其在不同的固定剂中的保存程度通常不同，比如酒精对组织中蛋白质的保存能力较差，而且在保存抗原及酶的活性方面也较差；许多脂类在四氧化锇或重铬酸盐中固定后保存完好，而在福尔马林中固定保存较差，在丙酮或酒精中固定过程中被吸除，因此酒精固定后，脂类无法染色。因此增加了后续染色的难度，对提高HE图片的质量有了更高的挑战。HE染色的核心是染液的选择，而染色效果主要取决于染色时间，在组织没有物理损伤的前提下，观察对照组和处理组之间的异同。尽管苏木素和伊红苏染液种类繁多，但是从它们的配方过程不难发现，二者不仅能溶于水，也易溶于醇溶液。HE染色过程中样品接触的主要溶液是水和不同梯度的酒精溶液，弱碱性水对某些苏木素染液有“反蓝作用”，如明矾苏木素，Carzzzi苏木素。而Mayer苏木素既可以用于进行性染色也可用于退行性染色，尤其是当需要核复染以突出特殊染色后的胞浆成分时，不需要水化，以免破坏或褪去胞浆成分的着色，Carzzzi苏木素也可用于进行性核复染，但是需要在自来水中蓝化。尽管伊红染色的着色强度及分化程度因人喜好而异，但通常会出现以下情况：一是由于汞盐固定的原因，伊红染色深而较难分化充分；二是由于逆酒精梯度脱水时，醇溶液过度分化，导致伊红易被洗脱，酒精被污染的同时造成染色质量下降，组织切片中仅有红细胞和嗜曙红颗粒着色，从而使染色出现偏差，影响着色质量，也造成实验耗材浪费；三是伊红作为胞浆染液，经常会出现真菌生长现象；四是是苏木素(胞核)着色较弱的现象。HE染色过程中，苏木素染色一次，但是要在水中蓝化一次，醇溶液中分化一次，特别是在醇溶液中分化，酒精分化速度快，无选择性，不易控制，从而导致苏木素染液洗脱，核着色较浅，影响观察。染色过程在脱水环节，绝大多数的伊红会被洗脱，各个梯度的醇溶液均会出现不同程度的污染，若不丢弃，会对后一批的染色造成颜色上的干扰，比如正常情况下肌纤维的着色为红色，红细胞的着色为橘红，而纤维素的着色为深粉色，污染后的醇溶液容易使不同组织间的着色发生混淆，影响观察。若丢弃，则会造成不必要的经济损失。最后，伊红处理过的组织切片，紧接着进行梯度酒精脱水，查阅众多文献发现，按照正常的脱水时间，伊红的着色会被严重洗脱，若减短脱水时间，则会导致脱水不足，后续封片中组织周围会形成水雾，严重影响观察。HE是目前最基础最广泛的组织学染色方法，也是实验探究过程中最直观的实验方法。因此精细化的染色，是制备HE切片的前提，也是决定能否在普遍性中找共性，在共性中找差异的基础。
技术实现思路
为解决上述技术问题，本专利技术通过调整HE染色过程中的步骤，从而使染色效果进一步优化，同样值得一提的是，通过优化染色程序，梯度脱水的醇溶液将不再被污染，可以循环实用，大大降低了科研成本。本专利技术具体技术方案如下：本专利技术的第一个目的是提供一种用于HE染色的天青石蓝溶液，包括天青石蓝B、硫酸铁铵、甘油、蒸馏水；所述天青石蓝B、硫酸铁铵、甘油、蒸馏水的重量体积比为重量体积比为2.5g：25g：50ml：450ml。；调整成分比例后在本专利技术中配套使用，效果显著提高。所述天青石蓝溶液的配置方法为：将硫酸铁铵溶解于冷蒸馏水中，搅拌均匀后加入天青石蓝B煮沸溶解，冷却过滤，加入甘油，用前过滤。本专利技术天青石蓝溶液中添加了高价铁盐，应用于HE染色时，可增强苏木素与细胞核的结合力，使胞核染色更深。在某个特定的实施方案中，天青石蓝溶液的体系如表1所示：表1本专利技术的第二个目的是提供一种用于HE染色的苏木素染液，包括苏木素、钾明矾、碘酸钠、柠檬酸、水合氯醛AR、蒸馏水；所述苏木素、钾明矾、碘酸钠、柠檬酸、水合氯醛AR、蒸馏水质量比为1:50:0.2:1:30:1000的；所述苏木素染液的配置方法为：将苏木素、钾明矾和碘酸钠在蒸馏水里室温过夜溶解后，加入水合氯醛AR和柠檬酸，混合物煮沸后5分钟，冷却过滤则制备完成，用前过滤。相对于现有技术，本专利技术在苏木素染液体系中，加入了新成分：柠檬酸，柠檬酸使该苏木素呈弱酸性体系，应用于HE染色时，可有效阻碍胞浆部分着色，使着色更具针对性，与此同时，弱酸环境可使后续蓝化过程在蒸馏水中即可完成，不再需要氨水处理，简化步骤，节省实验试剂。此外，在苏木素染液体系中加入水合氯醛AR，增强胞核金色离子的着色效果。在某个特定的实施方案中，苏木素染液的体系如表2所示：表2本专利技术的第三个目的是提供一种用于HE染色的伊红染液，包括1％伊红Y、1％四溴四氯荧光素钠B、100％酒精、乙酸、麝香草芬；所述伊红染液中，1％伊红Y、1％四溴四氯荧光素钠B、100％酒精、乙酸的体积比为5:1:93:1:4，所述1％伊红Y、1％四溴四氯荧光素钠B、100％酒精、乙酸的混合液与麝香草芬的比为250ml:1g；所述伊红染液的配置方法为：将1％伊红Y和1％四溴四氯荧光素钠B依次混入100％的酒精后，加入乙酸，最后加入麝香草芬低温避光溶解，HE染色实验前4个月制备，密封备用。相对于现有技术，本专利技术将四溴四氯荧光素钠B和伊红Y1：5配比使用，将适量乙酸加入伊红染液体系，应用于HE染色时，可增强着色。将适量麝香草芬加入伊红染液体系，可延长伊红的使用寿命。在某个特定的实施方案中本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于HE染色的天青石蓝溶液，其特征在于，所述天青石蓝溶液包括天青石蓝B、硫酸铁铵、甘油、蒸馏水；所述天青石蓝B、硫酸铁铵、甘油、蒸馏水的重量体积比为重量体积比为2.5g：25g：50ml：450ml。所述天青石蓝溶液通过将硫酸铁铵溶解于冷蒸馏水中，搅拌均匀后加入天青石蓝B煮沸溶解，冷却过滤，加入甘油后配置得到，用前过滤。

【技术特征摘要】
1.一种用于HE染色的天青石蓝溶液，其特征在于，所述天青石蓝溶液包括天青石蓝B、硫酸铁铵、甘油、蒸馏水；所述天青石蓝B、硫酸铁铵、甘油、蒸馏水的重量体积比为重量体积比为2.5g：25g：50ml：450ml。所述天青石蓝溶液通过将硫酸铁铵溶解于冷蒸馏水中，搅拌均匀后加入天青石蓝B煮沸溶解，冷却过滤，加入甘油后配置得到，用前过滤。2.一种用于HE染色的苏木素染液，其特征在于，所述苏木素染液包括苏木素、钾明矾、碘酸钠、柠檬酸、水合氯醛AR、蒸馏水；所述苏木素、钾明矾、碘酸钠、柠檬酸、水合氯醛AR、蒸馏水质量比为1:50:0.2:1:30:1000；所述苏木素染液通过将苏木素、钾明矾和碘酸钠在蒸馏水里室温过夜溶解后，加入水合氯醛AR和柠檬酸，混合物煮沸后5分钟，冷却过滤后配置得到，用前过滤。3.一种用于HE染色的伊红染液，其特征在于，所述伊红染液包括1％伊红Y、1％四溴四氯荧光素钠B、100.％酒精、乙酸、麝香草芬；所述伊红染液中，1％伊红Y、1％四溴四氯荧光素钠B、100.％酒精、乙酸的体积比为5:1:93:1:4，所述1％伊红Y、1％四溴四氯荧光素钠B、100.％酒精、乙酸的混合液与麝香草芬的比为250ml:1g；所述伊红染液通过将1％伊红Y和1％四溴四氯荧光素钠B依次混入100％酒精后，加入乙酸，最后加入麝香草芬低温避光溶解后配置得到，使用前4个月制备，密封备用。4.权利要求1所述的天青石蓝溶液或权利要求2所述的苏木素染液或权利要求3所述的伊红染液在HE染色中的应用。5.一种组织学切片HE染色方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：(1)将生物组织切片...

【专利技术属性】
技术研发人员：史志成，石放雄，刘迎，王喆，薛洋，
申请(专利权)人：南京农业大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32