一种基于CRISPR-Cas12a系统的运动发酵单胞菌基因组编辑方法及其应用技术方案

本发明专利技术属于基因编辑技术领域，尤其涉及一种基于CRISPR‑Cas12a系统的运动发酵单胞菌基因组编辑方法及其应用。旨在以运动发酵单胞菌Zymomonas mobilis ZM4为模式菌株，基于CRISPR‑Cas12a系统构建用于运动发酵单胞菌基因组编辑的方法，实现对基因组的定向编辑，为在该菌株中开展理性设计异源代谢途径及细胞工厂用于生物质燃料和生物材料的生产提供一套基因编辑工具，促进代谢工程等相关研究领域的发展。技术要点包括：构建诱导型表达的Cas12a重组菌株及含人工CRISPR表达单元的编辑质粒；设计向导RNA；将向导RNA引物序列退火后连接至编辑质粒中；将靶质粒转入感受态细胞表达编辑。

A genomic editing method of Zymomonas mobilis based on crispr-cas12a system and its application

【技术实现步骤摘要】
一种基于CRISPR-Cas12a系统的运动发酵单胞菌基因组编辑方法及其应用
本专利技术属于基因编辑
，尤其涉及一种基于CRISPR-Cas12a系统的运动发酵单胞菌基因组编辑方法及其应用。
技术介绍
近年来，随着合成生物学技术的发展和进步，利用微生物进行代谢工程改造和系统生物学研究受到越来越多的关注。以微生物为载体从廉价的可再生资源中生产生物燃料和增值化学品，为解决的化石资源短缺及其引发的相关环境问题提供了一个可替代方案。运动发酵单胞菌(Zymomonasmobilis)作为天然产乙醇菌株，具备独特ED代谢途径和较高的糖发酵效率，并且具有乙醇产量高、产生物量少、乙醇耐受力强、耐高渗透压等理想工业细胞工厂的特性，是目前构建生物燃料及其他生物及平台化合物的工程菌株的优选宿主之一。模型菌株Z.mobilisZM4的基因组序列已被确定，并且已被利用系统生物学数据完善了它的基因组注释，其基因组仅为2-M，约有1700多个编码区，有利于基因组规模代谢网络建模和代谢工程实践。目前已经在Z.mobilis实现了乳酸、琥珀酸、2-,3-丁二醇以及聚羟基丁酸(PHB)的尝试。通过去除基因组中生存本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于CRISPR‑Cas12a系统的运动发酵单胞菌基因组编辑方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1：构建诱导型表达的Cas12a重组菌株；步骤2：构建含人工CRISPR表达单元的编辑质粒；步骤3：根据编辑靶位点设计向导RNA，并设计向导RNA引物序列；步骤4：将向导RNA引物序列经退火后连接至含人工CRISPR表达单元的编辑质粒中，获得靶质粒；步骤5：将步骤4构建的靶质粒转入感受态细胞，进行表达编辑。

【技术特征摘要】
1.一种基于CRISPR-Cas12a系统的运动发酵单胞菌基因组编辑方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1：构建诱导型表达的Cas12a重组菌株；步骤2：构建含人工CRISPR表达单元的编辑质粒；步骤3：根据编辑靶位点设计向导RNA，并设计向导RNA引物序列；步骤4：将向导RNA引物序列经退火后连接至含人工CRISPR表达单元的编辑质粒中，获得靶质粒；步骤5：将步骤4构建的靶质粒转入感受态细胞，进行表达编辑。2.根据权利要求1所述的一种基于CRISPR-Cas12a系统的运动发酵单胞菌基因组编辑方法，其特征在于，在步骤4与步骤5之间增加步骤4’：获取供体DNA片段。3.根据权利要求2所述的一种基于CRISPR-Cas12a系统的运动发酵单胞菌基因组编辑方法，其特征在于：步骤5中，将靶质粒与供体DNA混合，通过电转化方法转入感受态细胞。4.根据权利要求2所述的一种基于CRISPR-Cas12a系统的运动发酵单胞菌基因组编辑方法，其特征在于：步骤5中，将靶质粒反向PCR扩增后，与供体DNA通过Gibson装配的方法进行连接后转入感受态细胞。5.根据权利要求1所述的一种基于CRISPR-Cas12a系统的运动发酵单胞菌基因组编辑方法，其特征在于：步骤1中将来源于Francisellanovicida的核酸酶Cas12a通过同源重组的方...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨世辉，沈威，彭文舫，马立新，
申请(专利权)人：湖北大学，
类型：发明
国别省市：湖北,42