一种基于全基因组CRISPR/Cas9文库筛选异种移植抗原基因的方法技术

本发明专利技术涉及一种基于全基因组CRISPR/Cas9文库筛选异种移植抗原基因的方法，属动物基因编辑技术领域。基于CRISPR/Cas9基因编辑系统，针对猪基因组范围内的全部基因各设计1‑2条靶向sgRNA，构建sgRNA慢病毒载体随机敲除文库并转染至HEK293T细胞中，收集病毒再转染至猪PK15细胞中，将转入病毒的猪PK15细胞包被到灵长类的胸腺或肾包膜下，或用人血清进行体外培养，分别在不同的时间内回收存活的细胞，再对回收的活细胞建立单细胞DNA文库或进行单细胞培养扩增后提取DNA，再用慢病毒载体上的通用引物扩增含有sgRNA的上述DNA片段，对敲除的单细胞基因位点进行定型，最终确定并查找出相关基因的信息。本发明专利技术的实施对猪作为异种器官移植过程中猪细胞表面新抗原的挖掘具有重要的指导意义。

A method of screening antigen genes of xenotransplantation based on CRISPR / cas9 Library

【技术实现步骤摘要】
一种基于全基因组CRISPR/Cas9文库筛选异种移植抗原基因的方法
本专利技术属于动物生物
，具体地说，涉及一种基于全基因组CRISPR/Cas9文库筛选异种移植抗原基因的方法。
技术介绍
器官移植作为治疗终末端器官衰竭患者的一种有效途径，在临床上得到了广泛应用。然而，我国目前每年可以实施临床器官移植的数量约为1万例，而等待器官移植的病人则有150万，等待器官移植与可进行器官移植患者的数量比值为150:1，器官短缺的形势依然很严峻。近年来，随着我国心脏病以及糖尿病等疾病患者的大幅增长，使得发展成为终末期肾、心、胰岛等组织器官衰竭的病人正在或将急剧增加，对器官移植需求的压力也将越来越大。而且，从2015年1月1日起，我国已经全面停止使用死囚器官作为移植供体来源，公民去世后自愿器官捐献将成为我国器官移植使用的最终来源，这势必导致器官供体本已日益短缺的形势更加严峻。因此，器官的严重短缺，最终将给病人家庭、社会和国家带来沉重负担，已成为全球性的社会问题，寻找新的供体来源来解决目前器官短缺的难题是当今社会面临的首要问题。目前，异种器官移植被公认为解决全球人类器官供体严重不足的有效途径，本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于全基因组CRISPR/Cas9文库筛选异种移植抗原基因的方法，其特征在于：具体步骤为：1）文库设计根据NCBI上猪的全基因组序列，基于CRISPR/Cas9基因编辑系统，对猪基因组中各个基因信息各设计1‑2个靶向sgRNA序列，构建sgRNA敲除文库；2）病毒载体的包被利用CustomArray芯片合成仪合成Array sgRNA oligo并对其进行纯化，再用Phusion HSFlex引物扩增sgRNA oligo并胶回收目的片段；lenti‑CRISPR‑GFP载体在限制性内切酶BsmBI的作用下酶切后并回收目的酶切载体；在Gibson ligation重组酶的作用下，将上述...

【技术特征摘要】
1.一种基于全基因组CRISPR/Cas9文库筛选异种移植抗原基因的方法，其特征在于：具体步骤为：1）文库设计根据NCBI上猪的全基因组序列，基于CRISPR/Cas9基因编辑系统，对猪基因组中各个基因信息各设计1-2个靶向sgRNA序列，构建sgRNA敲除文库；2）病毒载体的包被利用CustomArray芯片合成仪合成ArraysgRNAoligo并对其进行纯化，再用PhusionHSFlex引物扩增sgRNAoligo并胶回收目的片段；lenti-CRISPR-GFP载体在限制性内切酶BsmBI的作用下酶切后并回收目的酶切载体；在Gibsonligation重组酶的作用下，将上述酶切载体与回收片段进行重组，所获得的重组载体再转染至electrocompetentcell中，再将转化产物涂到羧苄青霉素的平板中，挑取单克隆扩增后提取无内毒素重组质粒，将质粒转染至HEK293T细胞中，60h后收集上清获得病毒载体；3）病毒载体的转染将不同的病毒量转染至猪PK15细胞，检测GFP表达量MOI，根据MOI值确定猪PK15细胞最佳的病毒体积，再按最佳病毒体积将病毒载体感染至PK15细胞，48h后，观察细胞GFP的表达率，并进一步确定病毒感染滴度；4）...

【专利技术属性】
技术研发人员：魏红江，赵恒，李鸿辉，角德灵，赵红业，
申请(专利权)人：云南农业大学，
类型：发明
国别省市：云南,53