一种无血清无DMSO组织工程骨冻存液及其制备和冻存方法技术

本发明专利技术涉及一种组织工程骨冻存液及其制备和冻存方法。本发明专利技术摒弃了DMSO和动物血清等常用的冻存液成分，而是采用以alpha‑MEM基础培养液为基质，联用了安全性较高的丙二醇、聚乙二醇、维生素C和谷氨酰胺。避免了DMSO对细胞的潜在化学毒性反应，也避免了血清传播动物源性病原体及病毒污染的风险。而且，采用本发明专利技术的冻存液，组织工程骨冻存的效果好，细胞复苏后活率高。冻存12周后，用本发明专利技术冻存液冻存的组织工程骨，复苏后细胞活率为90％以上，细胞增殖不改变、并维持成骨分化表型。

A serum-free and DMSO free tissue engineering bone cryopreservation solution and its preparation and cryopreservation method

【技术实现步骤摘要】
一种无血清无DMSO组织工程骨冻存液及其制备和冻存方法
本专利技术涉及组织工程
，具体涉及一种组织工程骨冻存液及其制备和冻存方法。
技术介绍
由于创伤、感染、畸形矫正与肿瘤切除等导致的大面积骨缺损临床常见，目前自体骨移植虽然是临床治疗的金标准，但是存在供区损伤和供体不足的缺陷。组织工程骨的构建与缺损修复可以替代自体骨移植，从而为克服这一问题开辟了新的途径。作为成体干细胞的一种，脂肪干细胞具有易取材、扩增能力强，具有多向分化潜能等优势。研究证明，脂肪干细胞可以稳定的向成骨细胞诱导分化，可以作为一种理想的种子细胞进行组织工程骨的构建。脱钙骨是一种传统的骨修复材料，具有良好的三维空间结构，能够保证细胞有充足的生长空间，作为组织工程的支架材料得以广泛应用。但是由于组织工程骨的体外构建耗时不能即刻应用，因而寻找一种合适的保存方法成为解决问题的关键。在骨组织的冻存中，虽然自体骨冻存的颅骨骨瓣修复应用于临床的报道。但是组织工程骨的保存报道较少，而且效果存在很大的差异。玻璃化冻存相对于慢速冻存而言，由于无冰晶形成，可以阻止冰晶破坏细胞膜和细胞器，保证细胞存活。目前玻璃化冻存在冻存组织工程血管，卵巢组织，胰腺组织中取得了初步成效。细胞的冻存过程会显著改变细胞的化学、物理和热力学环境，伴随有造成细胞生物性结构损伤的危险。为了将细胞在冻存、复苏过程中的损伤降至最低，必须进一步优化化学和温度操作过程，但需要在冻存前加入一种或一种以上的细胞冻存保护剂，在复苏后又将其去除。目前，最常用的冻存保护剂为二甲基亚砜(DMSO)，这种物质具有分子量小，溶解度大，易穿透细胞的特点，可使冰点下降，减少细胞内形成冰晶的机会，从而减少冰晶对细胞的损伤。由于高浓度DMSO对细胞有毒性，还必须添加其他的液体成分，如血清、细胞培养基，以降低DMSO的浓度，减少对细胞的伤害。另外，DMSO作为一种高致癌物，其在细胞产品中的应用势必会给病人带来潜在的致癌隐患。在目前的报道的细胞冻存液配方中，多采用DMSO联合动物血清，大部分为10％的DMSO与90％的胎牛血清，但由于DMSO含量仍较高，具有相当的毒性，对病人身体不利，并且胎牛血清中含有大量的异种蛋白，既有动物病原污染的危险，又很容易引起过敏反应或者免疫排斥，因此临床直接回输有很大的风险。并且，虽然目前国内外对干细胞或组织的冻存具有多种方案，但是对于组织工程骨这一特定的细胞材料复合物的冻存仍存在重重困难。因而存在寻找冻存组织工程骨的效果好同时危险性低的新型冻存液的需要。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术要解决的技术问题在于提供一种组织工程骨冻存液及其制备方法和应用，该组织工程骨冻存液不含DMSO和血清成分。为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：一种无血清无DMSO的组织工程骨冻存液，其特征在于，所述组织工程骨冻存液以不含血清的培养基为基质，冻存液中包括以下组分：丙二醇、聚乙二醇、维生素C和谷氨酰胺，余量为培养液。作为优选，每100mL所述组织工程骨冻存液的组分含量满足以下(a)-(d)中一个或多个条件：(a)所述丙二醇为5mL-16mL，更优选5mL-12mL；(b)所述聚乙二醇为5g-30g，更优选5g-20g；(c)所述维生素C为5mg-150mg，更优选10mg-120mg；或(d)所述谷氨酰胺为30mg-500mg，更优选50mg–150mg。作为优选，所述不含血清的培养基为alpha-MEM基础培养基。作为优选，每100mL组织工程骨冻存液中包括以下组分：余量为alpha-MEM培养液。本专利技术所述冻存液适用的组织工程骨包括脂肪干细胞复合猪源脱钙骨或脂肪干细胞复合人源脱钙骨；作为优选，所述脂肪干细胞包括自体脂肪干细胞或异体脂肪干细胞。本专利技术所使用的组织工程骨，可采用常规方法制备，优选含有接种密度为0.5-10×106个/mL的脂肪干细胞。本专利技术还提供组织工程骨冻存液的制备方法，通过将所述组织工程骨冻存液的配方中各组分混合制得。优选所述制备方法包括以下步骤：在不含血清的培养基中依次加入维生素C和谷氨酰胺，混匀；之后加入聚乙二醇，充分溶解后摇匀，最后加入丙二醇，混匀，过滤除菌后，置于4度避光保存备用。本专利技术还提供组织工程骨冻存液在冻存组织工程骨中的应用。所述组织工程骨优选脂肪干细胞复合猪源脱钙骨或脂肪干细胞复合人源脱钙骨；作为优选，所述脂肪干细胞包括自体脂肪干细胞或异体脂肪干细胞。使用本专利技术的组织工程骨冻存液冻存组织工程骨时，包括如下步骤：将组织工程骨取出，用生理盐水浸泡，然后与本专利技术的组织工程骨冻存液混合，冻存。作为优选，所述冻存方法包括如下步骤：将脂肪干细胞接种于脱钙骨支架，成骨诱导后取出细胞-支架材料复合物，置于冻存管中，加入所述组织工程骨冻存液，-80℃冻存；冻存一定时间后将冻存管移入液氮罐中保存。作为优选，所述冻存方法具体为：将脂肪干细胞悬液以0.5-10×106个/mL浓度接种于脱钙骨支架，加入成骨诱导液；诱导3-7天后，取出细胞-支架材料复合物，置于无菌离心管中，缓慢加入所述组织工程骨冻存液，液面超过支架材料，冻存；每冻存管中的冻存液为1mL，将冻存管放入程序降温盒中，经传递窗放入-80℃超低温冰箱中，次日将程序降温盒内的冻存管移入液氮罐中保存。本专利技术摒弃用DMSO和动物血清作为常用的冻存液成分，而是采用了以alpha-MEM基础培养液为基质，联用了安全性较高的丙二醇、聚乙二醇、维生素C和谷氨酰胺，使得组织工程骨的长期冻存成为可能，确保了冻存效果，同时还避免了传播潜在病原体的风险和DMSO对细胞的潜在毒性，提高了冻存的安全性和临床应用的安全性。本专利技术中使用的渗透性细胞膜内保护剂为1,2-丙二醇。丙二醇的粘性和吸湿性好，并且安全性高，在食品、医药和化妆品工业中被广泛应用。丙二醇在冻存液中的保护机制是在细胞冷冻悬液完全凝固之前，渗透到细胞内，在细胞内外产生一定的摩尔浓度，降低细胞内外未结冰溶液中的电解质的浓度，从而保护细胞免受高浓度电解质的损伤，同时，使细胞内的水分不会过度外渗，避免了细胞过分脱水皱缩。本专利技术中使用的非渗透性冷冻保护剂为聚乙二醇1500。聚乙二醇为环氧乙烷水解产物的聚合物，无毒、无刺激性，广泛应用于各种药物制剂中，除了能同溶液中的自由水结合，降低溶液中自由水的含量，使冰点降低，减少冰晶的形成，同时还可以防止或延缓细胞在冻存过程中的沉降，防止细胞互相挤压，影响细胞冻存效果。本专利技术的有益效果：与现有技术相比，本专利技术的组织工程骨冻存液不采用DMSO，避免了DMSO对细胞的潜在化学毒性反应，同时不采用动物血清，也避免了血清传播动物源性病原体及病毒污染的风险。传统干细胞冻存液在冻存组织工程骨时效果欠佳，而本专利技术提出的在alpha-MEM基础培养基中使用丙二醇、聚乙二醇、维生素C和谷氨酰胺的组合配方，使得组织工程骨的冻存成为可能，并取得了良好的冻存效果，细胞复苏后的活率高。冻存12周后，用本专利技术冻存液冻存的组织工程骨，复苏后培养7天，细胞活率为90％以上，细胞活性好、并维持成骨分化表型。实验结果证实，使用本专利技术的无血清配比构成的玻璃化冻存液，进行玻璃化冻存仍能够保持脂肪干细胞在脱钙骨上的增殖、成骨能力。另外，本专利技术的冻存液，由纯化学物质组成，成分稳定可控，保质期长，批次本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种无血清无DMSO的组织工程骨冻存液，其特征在于，所述组织工程骨冻存液以不含血清的培养基为基质，冻存液中包括以下组分：丙二醇、聚乙二醇、维生素C和谷氨酰胺，余量为培养液。

【技术特征摘要】
1.一种无血清无DMSO的组织工程骨冻存液，其特征在于，所述组织工程骨冻存液以不含血清的培养基为基质，冻存液中包括以下组分：丙二醇、聚乙二醇、维生素C和谷氨酰胺，余量为培养液。2.根据权利要求1所述的组织工程骨冻存液，其特征在于，每100mL所述组织工程骨冻存液的组分含量满足以下(a)-(d)中一个或多个条件：(a)所述丙二醇为5mL-16mL；(b)所述聚乙二醇为5g-30g；(c)所述维生素C为5mg-150mg；或(d)所述谷氨酰胺为30mg-500mg。3.根据权利要求1或2所述的组织工程骨冻存液，其特征在于，所述不含血清的培养基为alpha-MEM基础培养基。4.根据权利要求1-3任一项所述的组织工程骨冻存液，其特征在于，所述冻存液适用的组织工程骨包括脂肪干细胞复合猪源脱钙骨或脂肪干细胞复合人源脱钙骨。5.根据权利要求1-4任一项所述的组织工程骨冻存液的制备方法，其特征在于，将所述组织工程骨冻存液的配方中各组分混合。6.根据权利要求1-...

【专利技术属性】
技术研发人员：崔磊，
申请(专利权)人：崔磊，洪跟东，
类型：发明
国别省市：上海,31