确定腺相关病毒制剂的效价的方法技术

本文提供了测量基因治疗载体制剂的定性属性和/或数量属性的方法。在某些实施方式中，基因治疗载体制剂是腺相关病毒(AAV)制剂(例如AAV8)。在某些实施方式中，该方法包括使用ELISA或ELISA结合低温透射电子显微镜(CryoTEM)确定AAV制剂的效价或剂量。

Methods for determining the titer of adeno-associated virus preparations

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】确定腺相关病毒制剂的效价的方法相关申请本申请要求2017年3月3日提交的美国临时专利申请号62/467,045的优先权，其内容通过引用整体并入本文。
技术介绍
腺相关病毒(AAV，adeno-associatedvirus)是一种小型无包膜病毒，其包装线性单链DNA基因组。AAV属于Parvoviridae科和Dependovirus属，因为AAV的生产性感染(productiveinfection)仅在辅助病毒(例如腺病毒或疱疹病毒)存在下发生。即使在没有辅助病毒的情况下，AAV(血清型2)也可以通过整合到宿主人类基因组的染色体19q13.4中来实现潜伏。它是已知能够进行位点特异性整合的唯一哺乳动物DNA病毒(Daya和Berns,ClinicalMicrobiologyReviews,583–593页(2008))。为了在临床中安全使用AAV，AAV已在其基因组内的几个位置被基因修饰。例如，在许多病毒载体中，病毒复制所需的Rep基因和位点特异性整合所需的元件已从AAV基因组被除去。该重组AAV(rAAV)以染色体外状态存在，并且整合到基因组DNA的效率非常低。因此，即使未完全除去，rAAV在宿主细胞中诱导随机诱变的可能性也降低了。由于这些特性和缺乏致病性，rAAV作为基因治疗载体在临床前和临床应用的多个方面显示出巨大的前景。临床上正在检测新的血清型载体和自身互补型载体。除了这些正在进行的载体开发之外，持续的努力还集中在可扩展的制造工艺上，其可以有效地生产具有高纯度和高效价的高滴度量的rAAV载体。尽管在设计有效、大规模的方法以纯化适用于人类施用的AAV产品方面投入的努力已经取得进展，但仍需要分析方法以基于重组rAAV测量基因治疗载体制剂的质量属性，以允许产物释放和准确的临床剂量。例如，目前通过细胞培养生产AAV的方法会导致“空”衣壳的形成，“空”衣壳缺乏载体基因组并且已显示导致T细胞介导的免疫应答。此外，空衣壳不能提供与转基因产品(transgeneproduction)相关的治疗益处，并且可能会增加对载体的先天或适应性免疫应答(例如，T细胞介导的免疫应答)，因而使得空衣壳成为基因治疗景况的关注点。Wright，MolecularTherapy，22：1-2(2014)。传统上，定量PCR(qPCR)的使用是确定AAV制剂剂量的最广泛接受和优选的方法，因为它提供了载体基因组(例如载体基因组(vg)/kg受试者)的测量。参见HalbertCL等，JVirol，1997，71：5932-5941；SamulskiRJ等，JVirol，1989，63：3822-3828；ClarkKR等，HumGeneTher1999，10：1031-1039；和WrightJF，HumGeneTher，2011，22：519-521。然而，qPCR的使用受限于仅测量总DNA，这可能导致重大问题。例如，qPCR的读数可能受到一些问题的影响，例如，低效引物的使用、校准标准的问题或DNA三级结构(例如发夹结构、环状结构或超螺旋结构)。由于剂量计算中包含含有超过一个DNA拷贝的衣壳和/或破裂(fractured)衣壳，因此使用qPCR可导致确定的最终AAV制剂的剂量和最终效价(potency)不准确。这是因为AAV制剂的效价由两部分组成：1)AAV衣壳转导细胞的能力；和2)AAV中DNA产生所需产物的能力。不可用的(inoperable)衣壳(它不能用qPCR解释)不能有效地转导细胞。此外，qPCR也由于其固有变异性(即高达0.5log步长的高变异性)而受到限制，这可导致确定的最终AAV制剂的剂量不准确。由于样品制备，用qPCR所见的批间变异性(inter-assayvariability)也可能加重固有变异性，样品制备涉及几个步骤，包括衣壳蛋白消化、DNA提取和DNA纯化。如果不能准确地确定剂量和/或效价，则患者可能从治疗到治疗接受错误的剂量和/或广泛变化的剂量。因此，需要一种精确的工具来测量AAV制剂的剂量和最终效价，并监测基因治疗载体的质量和效价。
技术实现思路
本文提供了测量基因治疗载体制剂的数量属性(quantityattribute)的方法。在某些实施方式中，基因治疗载体制剂是腺相关病毒(AAV)制剂。本文公开的方法可用于任何纯化阶段(pointofpurification)。在某些实施方式中，可以在制备或包装供使用的AAV衣壳之前使用该方法。本文公开的方法可用于改善AAV制剂的浓度、剂量和/或效价的确定。细胞培养中AAV载体产生的特征是形成过量的“空”衣壳，“空”衣壳缺乏载体基因组。在某些实施方式中，评估空衣壳的量以精确确定AAV制剂的浓度、剂量和/或效价。空衣壳也可以被认为是与产品相关的杂质，纯化过程中应减少空衣壳。在某些实施方式中，重要的是确定空衣壳的总量以减少针对衣壳抗原的先天和/或适应性免疫应答。传统上，AAV制剂的浓度、剂量和/或效价依赖于通过定量PCR(qPCR)的定量测定。令人惊讶的是，本专利技术人发现：可以依靠单独的AAV特异性酶联免疫吸附测定(ELISA)来定量测定AAV制剂，并且它的使用可以改进AAV制剂的浓度和/或剂量的测量，从而最终改进效价的测量。本公开的方法优于本领域已知的那些方法，因为用ELISA测定抗原提供了高度可靠的结果，令人惊讶的是该结果比qPCR更准确。在某些实施方式中，该方法不包括通过qPCR测量浓度、剂量和/或效价的步骤。在某些实施方式中，浓度、剂量和/或效价可以通过AAV制剂中AAV衣壳的浓度来确定。在某些实施方式中，与使用qPCR的方法相比，本文公开的包含ELISA的方法使得AAV制剂的浓度、剂量和/或效价的变异性至少降低约10％。在某些实施方式中，与使用qPCR的方法相比，本文公开的包含ELISA的方法使得AAV制剂的浓度、剂量和/或效价的变异性至少降低约20％。在某些实施方式中，与使用qPCR的方法相比，本文公开的包含ELISA的方法使得AAV制剂的浓度、剂量和/或效价的变异性降低约10％至约80％。在某些实施方式中，与使用qPCR的方法相比，本文公开的包含ELISA的方法使得AAV制剂的浓度、剂量和/或效价的变异性降低约15％至约50％。在某些实施方式中，与使用qPCR的方法相比，本文公开的包含ELISA的方法使得AAV制剂的浓度、剂量和/或效价的变异性降低约20％至约33％。在某些方面，本专利技术的方法包括量化AAV制剂的剂量和/或效价。在某些实施方式中，该方法包括通过AAV特异性ELISA法检测AAV制剂以定量AAV制剂中AAV衣壳的总数。然后可以使用衣壳的数量来确定给受试者施用的剂量。剂量可用于确定效价(即产生某种效果(例如EC50)所需的剂量或浓度)。在某些实施方式中，该方法不包括通过qPCR测量剂量和/或效价的步骤。在某些方面，本专利技术的方法包括测量AAV级分或制剂中AAV衣壳的浓度。在某些实施方式中，该方法包括通过AAV特异性ELISA法检测AAV级分或制剂以定量AAV级分或制剂中AAV衣壳的总数。在某些实施方式中，该方法不包括通过qPCR测量浓度的步骤。在某些方面，本专利技术的方法包括测量AAV级分或制剂中的完整AAV衣壳的浓度。在某些实施方式中，该方法包括本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种量化AAV制剂剂量的方法，其中，所述方法包括：通过AAV特异性ELISA法定量AAV制剂中AAV衣壳的总数。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2017.03.03 US 62/467,0451.一种量化AAV制剂剂量的方法，其中，所述方法包括：通过AAV特异性ELISA法定量AAV制剂中AAV衣壳的总数。2.一种量化AAV制剂剂量的方法，其中，所述方法包括：通过AAV特异性ELISA法定量AAV制剂中AAV衣壳的总数，并通过低温透射电子显微镜CryoTEM评估AAV制剂中完整AAV衣壳相对空AAV衣壳的百分比或比率，即完整：空。3.一种测量AAV制剂中完整AAV衣壳浓度的方法，其中，所述方法包括：通过AAV特异性ELISA法定量AAV制剂中AAV衣壳的总数，并通过低温透射电子显微镜CryoTEM评估AAV制剂中完整AAV衣壳相对空AAV衣壳的百分比。4.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中，ELISA法是对AAV抗原具有特异性的夹心ELISA法、直接ELISA法、间接ELISA法或竞争性ELISA法。5.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中，ELISA法是对AAV抗原具有特异性的夹心ELISA法。6.如权利要求1所述的方法，其中，所述方法还包括：评估AAV制剂中完整AAV衣壳相对空AAV衣壳的百分比或比率，即完整：空。7.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中，评估步骤在ELISA法之前或之后进行。8.如权利要求6或7所述的方法，其中，评估步骤包括：通过低温透射电子显微镜CryoTEM、负染色TEM、毛细管电泳、分析超速离心、天然琼脂糖凝胶、碱性琼脂糖凝胶、Southern杂交、斑点杂交、紫外分光光度法、弱阴离子交换色谱或质谱，测定完整AAV衣壳：空AAV衣壳的百分比或比率。9.如权利要求6至8中任一项所述的方法，其中，评估步骤包括使用CryoTEM。10.如权利要求8或9所述的方法，其中，CryoTEM步骤包括：(i)将AAV制剂嵌入惰性载体的基质中；(ii)快速冷冻嵌入的AAV制剂；(iii)使用低温透射电子显微镜对嵌入的AAV制剂成像；(iv)定量AAV制剂中完整AAV衣壳相对空AAV衣壳的百分比。11.如权利要求10所述的方法，其中，基质是无定形的非晶冰。12.如权利要求10所述的方法，其中，AAV制剂不含细胞碎片。13.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述方法不包括定量PCR。14.一种给有需要的受试者施用AAV制剂的方法，其中，所述方法包括：(i)获得纯化的AAV制剂；(ii)使用AAV特异性ELISA法测量纯化的AAV制剂中AAV衣壳的浓度；(iii)给受试者施用治疗有效量的纯化的AAV制剂。15.如权利要求14所述的方法，其中，ELISA法是对AAV抗原具有特异性的夹心ELISA法、直接ELISA法、间接ELISA法或竞争性ELISA法。16.如权利要求14或15所述的方法，其中，ELISA法是对AAV抗原具有特异性的夹心ELISA法。17.如权利要求14至16中任一项所述的方法，其中，所述方法还包括：评估AAV制剂中完整AAV衣壳相对空AAV衣壳的百分比或比率，即完整：空。18.如权利要求17所述的方法，其中，评估步骤在ELISA法之前或之后进行。19.如权利要求17或18所述的方法，其中，评估步骤包括：通过CryoTEM、分析超速离心、天然琼脂糖凝胶、碱性琼脂糖凝胶、Southern杂交、斑点杂交、UV分光光度法、弱阴离子交换色谱或质谱，确定完整AAV衣壳：空AAV衣壳的百分比或比率。20.如权利要求17至19中任一项所述的方法，其中，评估步骤包括使用CryoTEM。21.如权利要求14至20中任一项所述的方法，其中，所述纯化的AAV制剂的浓度为约1×1010cp/ml至约1×1020cp/ml。22.如权利要求14至21中任一项所述的方法，其中，AAV制剂的治疗有效量为约1×1010cp/kg至约1×1016cp/kg的剂量。23.如权利要求14至22中任一项所述的方法，其中，所述方法不包括定量PCR。24.如权利要求14至23中任一项所述的方法，其中，受试者是人。25.一种给有需要的受试者施用特定剂量的AAV制剂的方法，其中，所述方法包括：(i)获得纯化的AAV制剂；(ii)使用AAV特异性ELISA法测量纯化的AAV制剂中AAV衣壳的浓度；(iii)给受试者施用特定剂量的纯化的AAV制剂。26.如权利要求25所述的方法，其中，ELISA法是对AAV抗原具有特异性的夹心ELI...

【专利技术属性】
技术研发人员：M·本迪克，R·尼西纳，E·伯姆，M·格兰因戈尔，C·菲德勒，
申请(专利权)人：百深公司，百深有限责任公司，
类型：发明
国别省市：美国,US