【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】引物延伸靶标富集及对其的包括同时富集DNA和RNA的改进专利
本专利技术涉及核酸测序的领域。更具体地,本专利技术涉及富集用于测序的稀有核酸靶标的领域。专利技术背景用于高通量测序的样品制备通常涉及富集步骤,其增加样品中的含有靶序列的核酸与非靶标核酸的比率。本领域中已知的基于序列的富集技术包括杂交捕获、PCR扩增、引物延伸靶标富集(PETE)。基于引物的靶标富集方法涉及一轮或多轮拷贝链的合成。DNA测序的一些临床应用目的在于检测非常稀有的靶标,例如癌症的血液中存在的无细胞肿瘤DNA(ctDNA)。特征在于突变的肿瘤DNA以低至每mL典型血液样品(capp纸)几个拷贝的浓度存在。需要利用尽可能少的来自患者的样品材料可靠地检测此类稀有的靶序列。专利技术概述在一个实施方案中,本专利技术是从样品富集靶标多核苷酸的方法,所述方法包括:提供包含所述靶标多核苷酸的样品;使第一靶标特异性引物与所述靶标多核苷酸杂交,其中所述引物包含靶标结合区域和与衔接子互补的区域;用DNA聚合酶延伸杂交的靶标特异性引物以形成引物延伸产物;使所述样品与包含具有5'-突出端的较长链和较短链的衔接子接触,其中所述5'-突出端包含与所述靶标特异性引物中的区域互补的区域,且所述较短链包含通用引发位点;使所述衔接子与所述引物延伸产物杂交;将所述衔接子的一条链连接至所述引物延伸产物以形成连接产物;使第二靶标特异性引物与所述引物延伸产物杂交,其中所述第二靶标特异性引物包含靶标结合位点和通用引发位点;利用与所述通用引发位点杂交的引物扩增所述连接产物。在一些实施方案中,引物退火和延伸步骤或引物退火和扩增步骤同 ...
【技术保护点】
1.从样品富集靶标多核苷酸的方法,所述方法包括:a) 提供包含所述靶标多核苷酸的样品;b) 使第一靶标特异性引物与所述靶标多核苷酸杂交,其中所述引物包含靶标结合区域和与衔接子互补的区域;c) 用DNA聚合酶延伸杂交的靶标特异性引物以形成引物延伸产物;d) 使所述样品与包含具有5'‑突出端的较长链和较短链的衔接子接触,其中所述5'‑突出端包含与所述靶标特异性引物中的区域互补的区域,且所述较短链包含通用引发位点;e) 使所述衔接子与所述引物延伸产物杂交;f) 将所述衔接子的一条链连接至所述引物延伸产物以形成连接产物;g) 使第二靶标特异性引物与所述引物延伸产物杂交,其中所述第二靶标特异性引物包含靶标结合位点和通用引发位点;h) 利用与所述通用引发位点杂交的引物扩增所述连接产物。
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2017.03.08 US 62/468569;2017.10.06 US 62/5694751.从样品富集靶标多核苷酸的方法,所述方法包括:a)提供包含所述靶标多核苷酸的样品;b)使第一靶标特异性引物与所述靶标多核苷酸杂交,其中所述引物包含靶标结合区域和与衔接子互补的区域;c)用DNA聚合酶延伸杂交的靶标特异性引物以形成引物延伸产物;d)使所述样品与包含具有5'-突出端的较长链和较短链的衔接子接触,其中所述5'-突出端包含与所述靶标特异性引物中的区域互补的区域,且所述较短链包含通用引发位点;e)使所述衔接子与所述引物延伸产物杂交;f)将所述衔接子的一条链连接至所述引物延伸产物以形成连接产物;g)使第二靶标特异性引物与所述引物延伸产物杂交,其中所述第二靶标特异性引物包含靶标结合位点和通用引发位点;h)利用与所述通用引发位点杂交的引物扩增所述连接产物。2.权利要求1的方法,其中所述衔接子的较短链的长度短于或等于所述5'-突出端的长度的1.5倍。3.权利要求1-2的方法,其中所述衔接子在3'-末端包含延伸阻断,其优选为3'-或2'-磷酸酯基团。4.权利要求1-3的方法,其中所述第一和第二靶标特异性引物中的至少一者包含条形码,其优选为独特的分子条形码(UID)和样品条形码(SID)。5.权利要求1-4的方法,其中步骤h)中的扩增包括数字液滴PCR。6.从样品富集靶标多核苷酸的方法,所述方法包括:a)提供包含单链RNA和双链DNA形式两者的靶标多核苷酸的样品;b)使第一靶标特异性引物与所述靶标多核苷酸的单链RNA形式杂交,其中所述引物包含靶标结合区域和与衔接子互补的区域;c)用逆转录酶延伸杂交的第一靶标特异性引物,以形成包含RNA链和第一引物延伸产物的双链RNA-DNA杂合体;d)使所述样品经受双链核酸变性条件;e)使第二靶标特异性引物与变性的DNA杂交,其中所述引物包含靶标结合区域和与所述衔接子互补的区域;f)用DNA聚合酶延伸杂交的第二靶标特异性引物以形成第二引物延伸产物;g)使所述样品与包含较长链和较短链的衔接子接触,其中所述较长链包含与所述靶标特异性引物中的区域互补的区域,且所述较短链包含通用引发位点;h)使所述衔接子与所述第一和第二引物延伸产物杂交;i)将所述衔接子的一条链连接至所述第一和第二引物延伸产物以形成连接产物;j)使第三靶标特异性引物与所述第一引物延伸产物杂交,和使第四引物与所述第二引物延伸产物杂交,其中所述第三和第四靶标特异性引物包含靶标结合位点和通用引发位点;k)利用与所述通用引发位点杂交的引物扩增所述连接产物。7.权利要求6的方法,其中所述第一和第二靶标特异性引物包含独特的分子条形码。8.从样品测序靶标多核苷酸的方法,所述方法包括:a)提供包含单链RNA和双链DNA形式两者的靶标多核苷酸的样品;b)使第一靶标特异性引物与所述靶标多核苷酸的单链RNA形式杂交,其中所述引物包含靶标结合区域和与衔接子互补的区域;c)用逆转录酶延伸杂交的第一靶标特异性引物,以形成包含RNA链和第一引物延伸产物的双链RNA-DNA杂合体;d)使所述样品经受双链核酸变性条件;e)使所述第二靶标特异性引物与变性的DNA杂交;f)用DNA聚合酶延伸杂交的第二靶标特异性引物以形成第二引物延伸产...
【专利技术属性】
技术研发人员:BC戈德温,S奥茨特克,
申请(专利权)人:豪夫迈·罗氏有限公司,
类型:发明
国别省市:瑞士,CH
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。