使用抗体的靶标核酸浓缩和回收方法技术

本发明专利技术的目的是提供一种有效的核酸回收方法，该方法能够从含有核酸的样品中浓缩核酸，使得所述核酸可用于基因扩增反应。为了解决该问题，本发明专利技术人发现了通过靶向与核酸结合的蛋白质(下文中也称为核蛋白或蛋白质‑核酸复合物)而不是靶向核酸本身，或具体地，通过使针对蛋白质的特异性抗体起作用，可以与蛋白质同时捕获核酸，从而完成本发明专利技术。此外，本发明专利技术人已经发现，如果动物细胞、细菌、病毒等具有与细胞中(在病毒的情况下在包膜中)存在的蛋白质相结合的核酸，则在用表面活性剂处理细胞后，可以通过使用针对核蛋白的特异性抗体捕获并回收结合的核酸，而不将核酸从蛋白质中解离。

Concentration and recovery of target nucleic acid using antibody

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】使用抗体的靶标核酸浓缩和回收方法
本专利技术涉及从含有核酸的样品如生物样品中浓缩和回收靶核酸的技术。
技术介绍
Boom方法(非专利文献1)作为从生物样品、细菌、病毒等中浓缩和回收核酸的方法而广泛应用。在该方法中，首先，在含有硫氰酸根离子、氯酸根离子等的离液盐的存在下，核酸与硅胶颗粒结合，然后，用约70％的醇水溶液(如乙醇水溶液和异丙醇水溶液)洗涤二氧化硅珠，以除去离液盐和污染物。随后，干燥二氧化硅珠以除去醇(例如乙醇和异丙醇)，然后可以用低浓度缓冲液或水分离和回收吸附在二氧化硅珠上的核酸。回收的核酸适用于基因扩增反应(PCR(聚合酶链反应)、LAMP(环介导的等温扩增)等)、与逆转录组合的基因扩增反应(逆转录PCR(RT-PCR)、使用逆转录酶的LAMP等)。从人类生物样品(血液、尿液、组织等)中回收的核酸用于疾病诊断并且用作用于预测治疗剂效果的指标。例如，对于肺癌患者的EGFR(表皮生长因子受体)基因的突变检查是通过使用从肺癌组织中浓缩和回收的DNA以boom方法等进行，并且已经临床应用作为用于确定用酪氨酸激酶抑制剂治疗的效果的重要检查。通常，来自癌症患者的活组织检查即用于活检目的的一块组织的收集，是高度侵入性的。特别是对于易于复发的肺癌患者，经常需要活组织检查，但由于侵入性问题，在许多情况下很难进行活组织检查。作为替代，近年来还研究了回收和检查在血液中循环的DNA片段(ccfDNA；无循环细胞的DNA)的方法。已知真核生物染色体DNA包裹在组蛋白蛋白质周围，当由于细胞凋亡而发生细胞死亡时，DNA在未包裹在组蛋白周围的区域被破坏；因此，据报道，只有包裹在组蛋白周围的区域可以作为ccfDNA存在而不被破坏(非专利文献2)。该ccfDNA也可以通过应用boom方法作为DNA片段回收，并且已经出售了试剂盒(“QIAampCirculatingNucleicAcidKit”，目录号55114，由Qiagen制造)。用于传染病检查的细菌和病毒测试在临床上应用作为POC测试，例如使用针对细胞膜和细胞内蛋白质的特异性抗体的免疫层析法。其中，特别是对于流感感染，POC测试通常由于在感染早期缺乏灵敏度而导致假阴性，并且还开发了使用流感病毒RNA的高灵敏度检测系统。已知流感病毒RNA以螺旋方式包裹在包膜(envelope)内被称为NP蛋白的核蛋白周围，并且该RNA可通过利用boom方法的方法回收。专利文献1公开了使用与细胞mRNA蛋白质(mRNP)复合物中包含的RNA结合蛋白或RNA缔合蛋白质相结合的配体、配体特异性的结合分子以及结合分子所附着的固体支持物来分离和表征内源性mRNP复合物的方法。引用列表专利文献专利文献1：日本未审查专利申请公开No.2004-520002非专利文献非专利文献1：J.Clin.Microbiol.1990(28)495-503.非专利文献2：Cell，2016(164)57-68.专利技术概述技术问题在boom方法中或在应用boom方法的浓缩和回收核酸的方法中，当浓缩和回收的核酸用作扩增反应的模板时，如果混入离液盐，则可抑制反应，因此，需要用不会引起吸附在其上的核酸的解离的高浓度的醇(约70％的醇水溶液，如乙醇水溶液、异丙醇水溶液等)充分洗涤二氧化硅珠。此外，如果将洗涤溶液中的醇混入，则可抑制反应，因此需要对二氧化硅珠进行充分的干燥操作。因此，期望通过消除离液盐和醇的使用来实现核酸回收操作的时间减少和简化。本专利技术的目的是提供一种有效的核酸回收方法，该方法能够在不使用离液盐或醇的情况下从含有核酸的样品中浓缩核酸。解决问题的方案为了解决该问题，本专利技术人发现了通过使用与核酸结合的蛋白质(下文中也称为核蛋白或蛋白质-核酸复合物)作为靶标而不是使用核酸本身作为靶标，或具体地，通过使针对蛋白质的特异性抗体起作用，可以与蛋白质同时捕获核酸，从而完成本专利技术。此外，本专利技术人已经发现，如果动物细胞、细菌、病毒等具有与细胞中(在病毒的情况下在包膜中)存在的蛋白质相结合的核酸，则可以用表面活性剂处理与核蛋白结合的核酸，并由此通过使用针对所述核蛋白的特异性抗体捕获、浓缩和回收所述核酸，而不从蛋白质中解离所述核酸用于浓缩和回收(术语“浓缩”可以替换表述为“提取”或“捕获”，以下同样适用)。因此，本专利技术提供以下[实施方案1]至[实施方案27]。[实施方案1]浓缩核酸的方法，包括以下步骤(a)至(c)：(a)提供含有蛋白质-核酸复合物的样品，其中蛋白质和核酸是结合的；(b)使所述样品、与所述蛋白质特异性反应的抗体和能够吸附所述抗体的载体相互接触；和(c)从所述样品中回收所述载体，以便在所述载体上获得浓缩的核酸。[实施方案2]根据实施方案1所述的方法，进一步包括步骤(d)将所述浓缩的核酸与所述载体分离。[实施方案3]根据实施方案1或2所述的方法，其中在步骤(b)中，接触的所述载体是抗体支持载体，其中所述抗体由所述载体支持。[实施方案4]根据实施方案3所述的方法，其中在步骤(d)中，通过免疫反应从附着于所述抗体支持载体的蛋白质-核酸复合物中释放所述核酸。[实施方案5]根据实施方案1至4中任一项所述的方法，其中在步骤(b)中，所述抗体和所述蛋白质-核酸复合物彼此结合以形成抗体-蛋白质-核酸复合物。[实施方案6]根据实施方案5所述的方法，其中在步骤(d)中，从通过物理吸附而吸附于所述载体的抗体-蛋白质-核酸复合物中释放所述核酸。[实施方案7]根据实施方案1至6所述的方法，在步骤(a)之前、在步骤(a)中或在步骤(a)与步骤(b)之间进一步包括以下步骤(a′)：(a′)将表面活性剂添加到含有所述蛋白质-核酸复合物的样品中。[实施方案8]根据实施方案7所述的方法，其中所述表面活性剂是选自非离子表面活性剂、阳离子表面活性剂、阴离子表面活性剂和两性表面活性剂中的一种或多种。[实施方案9]根据实施方案1至8任一项所述的方法，其中所述样品是选自生物样品和含有病原微生物或病毒的样品中的一种或多种。[实施方案10]根据实施方案9所述的方法，其中所述生物样品是动物细胞。[实施方案11]根据实施方案10所述的方法，其中所述生物样品是选自血液、血浆、血清、尿液、粪便、胆汁、胰液、鼻涕和鼻腔/咽拭子液中的一种或多种。[实施方案12]根据实施方案9所述的方法，其中所述含有病原微生物或病毒的样品是病原微生物或病毒的培养物。[实施方案13]根据实施方案9所述的方法，其中所述病毒是流感病毒。[实施方案14]根据实施方案1至13任一项所述的方法，其中所述蛋白质是核蛋白。[实施方案15]根据实施方案14所述的方法，其中所述核蛋白是选自组蛋白和核衣壳蛋白中的一种或多种。[实施方案16]根据实施方案1至15任一项所述的方法，其中与所述蛋白质-核酸复合物特异性反应的所述抗体是识别核蛋白的抗体。[实施方案17]根据实施方案16所述的方法，其中所述识别核蛋白的抗体是选自抗组蛋白抗体和识别核衣壳蛋白的抗体中的一种或多种。[实施方案18]根据实施方案1至17任一项所述的方法，其中所述核酸是不包括信使RNA(mRNA)的核酸。[实施方案19]根据实施方案1至18任一项所述的方法，其中所述所述核酸选自由以下各项组成的组：藻类DNA、藻类RNA、古细菌DNA、古细菌RN本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.浓缩核酸的方法，包括以下步骤(a)至(c)：(a)提供含有蛋白质‑核酸复合物的样品，其中蛋白质和核酸是结合的；(b)使所述样品、与所述蛋白质特异性反应的抗体和能够吸附所述抗体的载体相互接触；和(c)从所述样品中回收所述载体，以便在所述载体上获得浓缩的核酸。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2017.03.27 JP 2017-0608421.浓缩核酸的方法，包括以下步骤(a)至(c)：(a)提供含有蛋白质-核酸复合物的样品，其中蛋白质和核酸是结合的；(b)使所述样品、与所述蛋白质特异性反应的抗体和能够吸附所述抗体的载体相互接触；和(c)从所述样品中回收所述载体，以便在所述载体上获得浓缩的核酸。2.根据权利要求1所述的方法，进一步包括步骤(d)将所述浓缩的核酸与所述载体分离。3.根据权利要求1或2所述的方法，其中在步骤(b)中，接触的所述载体是抗体支持载体，其中所述抗体由所述载体支持。4.根据权利要求3所述的方法，其中在步骤(d)中，通过免疫反应从附着于所述抗体支持载体的蛋白质-核酸复合物中释放所述核酸。5.根据权利要求1至4任一项所述的方法，其中在步骤(b)中，所述抗体和所述蛋白质-核酸复合物彼此结合以形成抗体-蛋白质-核酸复合物。6.根据权利要求5所述的方法，其中在步骤(d)中，从通过物理吸附而吸附于所述载体的抗体-蛋白质-核酸复合物中释放所述核酸。7.根据权利要求1至6所述的方法，在步骤(a)之前、在步骤(a)中或在步骤(a)与步骤(b)之间进一步包括以下步骤(a′)：(a′)将表面活性剂添加到含有所述蛋白质-核酸复合物的样品中。8.根据权利要求7所述的方法，其中所述表面活性剂是选自非离子表面活性剂、阳离子表面活性剂、阴离子表面活性剂和两性表面活性剂中的一种或多种。9.根据权利要求1至8任一项所述的方法，其中所述样品是选自生物样品和含有病原微生物或病毒的样品中的一种或多种。10.根据权利要求9所述的方法，其中所述生物样品是动物细胞。11.根据权利要求10所述的方法，其中所述生物样品是选自血液、血浆、血清、尿液、粪便、胆汁、胰液、鼻涕和鼻腔/咽拭子液中的一种或多种。12.根据权利要求9所述的方法，其中所述含有病原微生物或病毒的样品是病原微生物或病毒的培养物。13.根据权利要求9所述的方法，其中所述病毒是流感病毒。14.根据权利要求1至13任一项所述的方法，其中所述蛋白质是核蛋白。15.根据权利要求14所述的方法，其中所述核蛋白是选自组蛋白和核衣壳蛋白中的一种或多种。16.根据权利要求1至15任一项所述的方法，其中与所述蛋白质-核酸复合物...

【专利技术属性】
技术研发人员：海老沼宏幸，内田桂，
申请(专利权)人：积水医疗株式会社，
类型：发明
国别省市：日本,JP