生物样品中降解酶和非降解酶的检测、鉴定与纯化制造技术

提供了鉴定、观察和纯化来自复杂生物样品的蛋白酶的方法。

Detection, identification and purification of degradation and non degradation enzymes in biological samples

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】生物样品中降解酶和非降解酶的检测、鉴定与纯化相关申请交叉引用本申请要求2016年10月11日提交的美国临时申请系列号62/406,781的优先权，其通过引用全文纳入本文。
本公开一般涉及检测复杂生物样品中蛋白酶活性的方法，具体是在无需样品处理的情况下，检测复杂生物样品(例如血液、血浆或血清)中降解和非降解酶活性的方法。
技术介绍
已经鉴定了超过300种蛋白质翻译后修饰，它们大幅影响蛋白质功能，定位，活性和结构。常见的翻译后修饰包括磷酸化，糖基化，小蛋白质如泛素和SUMO(小泛素相关修饰物)的偶联，以及N末端和赖氨酸残基的乙酰化，但蛋白质的蛋白水解修饰的重要性和普遍性往往被忽视。实际上，许多疾病的生物标志物是生物体液中的稳定蛋白水解片段。蛋白酶是在蛋白质和多肽内进行肽键水解的酶。除了它们在消化和蛋白质转换中的作用外，蛋白酶在严格调控的级联和信号转导事件中起作用。通过精确的蛋白水解加工，蛋白酶参与每个生物过程，包括DNA复制和修复，细胞周期进程，细胞增殖，分化和迁移，形态发生和组织重塑，神经元突触生长，止血，伤口愈合，免疫，血管生成和细胞凋亡。实际上，人们已经认识到超过53种特定的蛋白水解遗传性疾病，因此蛋白酶与许多病症有关并不奇怪。此外，许多病原体在侵入其宿主期间利用蛋白酶，在宿主内复制，或调节宿主的免疫应答。由于这些原因，认为蛋白酶是治疗介入的重要靶标。蛋白酶占药物靶标的5-10％。有六类蛋白酶占任何生物基因的约2％(参见肽酶数据库MEROPs获取有用信息)，次于泛素连接酶，蛋白酶构成人类第二大酶家族，总共有超过567种蛋白酶。已经开发了几种蛋白酶抑制剂用于抗HIV感染，多发性骨髓瘤和高血压等疾病的药物。尽管取得了这些成功，但由于对靶向的蛋白酶功能作用缺乏选择性或有错误认识，许多蛋白酶抑制剂在临床试验中失败。这些例子强调了在作为早期药物发现过程、生命科学研究和诊断开发的一部分的更复杂和生物学相关的环境中更好地理解蛋白酶活性的重要性。
技术实现思路
本文提供了检测复杂生物样品中的蛋白酶活性的方法，尤其是在无需样品处理的情况下，检测复杂生物样品中降解和非降解酶活性的方法。在一些实施方式中，复杂生物样品选自血液、血浆和血清。本文提供了鉴定复杂生物样品中蛋白酶活性的方法，包括：a)获得复杂生物样品；b)将该复杂样品与底物文库和标签孵育，以产生裂解产物；c)从该复杂样品分离裂解产物；和d)产生复杂样品的蛋白水解特征。在所述方法的一些实施方式中，复杂生物样品是全血。在所述方法的一些实施方式中，底物文库是合成肽文库。在一些实施方式中，合成肽文库包含以下部分的组合：氨基酸对，带正电和带负电的残基，或沿合成肽长度的不同位置处的修饰残基。在所述方法的一些实施方式中，通过凝胶电泳，毛细管电泳或DC和AC动电学技术的组合将裂解产物与复杂样品分离。在所述方法的一些实施方式中，通过根据迁移检测和对肽混合物中的个体底物进行分级来产生底物特征。在一些实施方式中，个体底物通过标签检测。在一些实施方式中，标签是荧光染料，放射性探针或亲和标签。在所述方法的一些实施方式中，蛋白水解特征包含多类蛋白酶活性。在一些实施方式中，多类蛋白酶活性选自丝氨酸，半胱氨酸，苏氨酸，天冬氨酰和金属肽酶活性。在一些实施方式中，通过将复杂样品与活性抑制剂分开孵育来检测多类蛋白酶活性。在一些实施方式中，活性抑制剂选自金属螯合剂、半胱氨酸肽酶抑制剂和弹性蛋白酶特异性抑制剂。在一些实施方式中，活性抑制剂选自EDTA，E-64，CAO74和氯甲基酮抑制剂。本文提供了纯化生物样品中的蛋白酶的方法，包括：a)获得生物样品；b)使样品与基于活性的探针(ABP)接触，所述探针包含与带正电的部分连接的化学反应性基团，其中ABP结合生物样品中蛋白酶的活性位点，并且ABP的带正电的部分保持暴露在蛋白酶活性位点外；和c)分离已结合ABP的蛋白酶。在所述方法的一些实施方式中，化学反应性基团通过间隔分子与带正电的部分连接。在所述方法的一些实施方式中，通过在体外将ABP与样品一起孵育来进行接触。在一些实施方式中，化学反应性基团与活性位点亲核残基不可逆地反应。在一些实施方式中，通过电泳分离将已结合ABP的蛋白酶与样品分离。本文提供了观察生物样品中的蛋白酶的方法，包括：a)获得生物样品；b)使样品与基于活性的探针(ABP)接触，所述探针包含与带正电的部分连接的化学反应性基团，其中ABP结合生物样品中蛋白酶的活性位点，并且ABP的带正电的部分保持暴露在蛋白酶活性位点外；和c)观察已结合ABP的蛋白酶。在所述方法的一些实施方式中，接触通过体内注射ABP进行。在一些实施方式中，化学反应性基团通过间隔分子与带正电的部分连接。在一些实施方式中，化学反应性基团与活性位点亲核残基不可逆地反应。在一些实施方式中，ABP还包含标签。在一些实施方式中，标签是荧光染料或放射性探针。在一些实施方式中，该方法还包括在观察位置进行活检。在一些实施方式中，观察的位置是肿瘤。在一些实施方式中，该方法还包括通过电泳分离法分离已结合ABP的蛋白酶。本文提供了观察体内酸性微环境中蛋白酶活性的方法，该方法包括，将带负电的荧光标记的肽或纳米颗粒注入生物体中，其中所述肽或纳米颗粒进入酸性微环境并在微环境中被蛋白酶裂解，以产生带正电的荧光裂解产物；和，观察裂解产物。在所述方法的一些实施方式中，酸性微环境在肿瘤中。在一些实施方式中，裂解产物粘附于肿瘤的细胞表面。本文提供了通过接触角测量来检测复杂生物样品中的两亲性酶底物的方法，包括：a)将复杂生物样品的液滴与两亲性底物一起孵育，所述两亲性底物平衡蛋白酶裂解位点周围的疏水性和亲水性，其中亲水和疏水产物从两亲性底物释放；和b)测量当疏水裂解产物迁移到液滴表面处的液滴-空气界面表面时形成的接触角，其中接触角的减小指示蛋白酶活性。本文提供了通过荧光检测复杂生物样品中的两亲性酶底物的方法，包括：a)将复杂生物样品的液滴与荧光标记的两亲性底物一起孵育，所述两亲性底物平衡蛋白酶裂解位点周围的疏水性和亲水性，其中亲水和疏水产物从两亲性底物释放；和b)测量迁移到液滴表面处的液滴-空气界面表面的疏水裂解产物的荧光，荧光指示蛋白酶活性。本文提供了检测生物样品中非降解性电荷转移酶的方法，包括，将带正电的底物与复杂样品孵育，其经设计以在通过样品中的激酶磷酸化之后带负电，和，测量电泳凝胶中的荧光。在所述方法的一些实施方式中，底物包含选自丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸及其组合的残基。附图说明图1A-1B显示底物文库的使用和所得的底物裂解模式以鉴定样品中的酶。图1A说明了非靶向的底物文库的使用和所得的底物裂解模式，以鉴定样品中的多种酶。图1B说明了底物组和所得的底物裂解模式，以区分具有重叠裂解特异性的酶，例如MMP-2(上图)和MMP-9(下图)。图2A-2D显示用于蛋白酶纯化的具有带电部分的基于活性的探针。图2A显示具有带负电的抑制区和带正电的尾部的蛋白酶抑制剂分子。图2B显示蛋白酶结合抑制剂分子并掩蔽带负电的抑制区，而尾部保持暴露于正电荷，但不裂解分子。图2C显示对样品施加电场以将带负电的血液组分与带正电的蛋白酶/抑制剂分离。图2D显示该方法用于通过分离所有抑制的蛋白酶并表征脱靶蛋白酶来筛选复杂样品中的抑制剂分子。图3本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种鉴定复杂生物样品中的蛋白酶活性的方法，包括：a)获得复杂生物样品；b)将该复杂样品与底物文库和标签孵育，以产生裂解产物；c)将裂解产物与复杂样品分离；和d)产生复杂样品的蛋白水解特征。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2016.10.11 US 62/406,7811.一种鉴定复杂生物样品中的蛋白酶活性的方法，包括：a)获得复杂生物样品；b)将该复杂样品与底物文库和标签孵育，以产生裂解产物；c)将裂解产物与复杂样品分离；和d)产生复杂样品的蛋白水解特征。2.如权利要求1所述的方法，其中，所述复杂生物样品是全血。3.如权利要求1所述的方法，其中，所述底物文库是合成肽文库。4.如权利要求3所述的方法，其中，合成肽文库包含以下的组合：氨基酸对，带正电和带负电的残基，或沿合成肽长度的不同位置处的修饰残基。5.如权利要求1所述的方法，其中，所述标签是荧光染料、放射性探针，或亲和标签。6.如权利要求1所述的方法，其中，所述裂解产物通过凝胶电泳、毛细管电泳或DC和AC动电学技术的组合将与复杂样品分离。7.如权利要求1所述的方法，其中，所述底物特征通过根据迁移检测和对肽混合物中的个体底物进行分级来产生。8.如权利要求7所述的方法，其中，所述个体底物通过标签检测。9.如权利要求8所述的方法，其中，所述标签是荧光染料、放射性探针，或亲和标签。10.如权利要求1所述的方法，其中，所述蛋白水解特征包含多个蛋白酶活性类别。11.如权利要求10所述的方法，其中，所述多个蛋白酶活性类别选自丝氨酸、半胱氨酸、苏氨酸、天冬氨酰，和金属肽酶活性。12.如权利要求10所述的方法，其中，所述多个蛋白酶活性类别通过将复杂样品与活性抑制剂分开孵育来检测。13.如权利要求12所述的方法，其中，所述活性抑制剂选自金属螯合剂、半胱氨酸肽酶抑制剂和弹性蛋白酶特异性抑制剂。14.如权利要求13所述的方法，其中，所述活性抑制剂选自EDTA、E-64、CAO74，和氯甲基酮抑制剂。15.一种纯化生物样品中的蛋白酶的方法，包括：a)获得生物样品；b)使所述样品与基于活性的探针(ABP)接触，所述基于活性的探针包含与带正电的部分连接的化学反应性基团，其中，该ABP结合生物样品中的蛋白酶的活性位点，并且该ABP的带正电的部分保持暴露在蛋白酶活性位点外；和c)分离已结合ABP的蛋白酶。16.如权利要求15所述的方法，其中，所述化学反应性基团通过间隔分子与带正电的部分连接。17.如权利要求15所述的方法，其中，接触通过将ABP与样品体外孵育来进行。18.如权利要求15所述的方法，其中，所述化学反应性基团与活性位点亲核残基不可逆地反应。19.如权利要求15所述的方法，其中，已结合ABP的...

【专利技术属性】
技术研发人员：M·J·海勒，A·E·莫得斯提诺，G·W·施米德肖贝恩，E·斯科隆斯基，C·雷特勒，
申请(专利权)人：加利福尼亚大学董事会，
类型：发明
国别省市：美国,US