一种糖化血红蛋白荧光亲和免疫层析检测试剂盒及检测方法技术

本发明专利技术公开了一种糖化血红蛋白荧光亲和免疫层析检测试剂盒及检测方法。其包括：稀释液，所述稀释液为用于溶血、孵育、滴样的缓冲液；荧光免疫微球溶液，所述荧光免疫微球溶液为用于提供准确、灵敏荧光信号的标记载体；荧光亲和免疫层析试纸条，所述荧光亲和免疫层析试纸条为含底板、样品垫、硝酸纤维素膜(有硼酸亲和层析区和质控线)和吸水纸的侧向层析试纸条；糖化血红蛋白荧光亲和免疫层析检测试剂盒检测方法，所述试剂盒检测方法包括溶血方法、荧光免疫微球孵育方法及滴样检测方法。该检测试剂盒综合了亲和层析柱法和荧光免疫层析法的优势，可高精确度、高灵敏度检测糖化血红蛋白。

【技术实现步骤摘要】
一种糖化血红蛋白荧光亲和免疫层析检测试剂盒及检测方法
本专利技术涉及糖化血红蛋白检测
，尤其涉及一种糖化血红蛋白荧光亲和免疫层析检测试剂盒及检测方法。
技术介绍
糖化血红蛋白(HbA1c)的准确定义是葡萄糖与血红蛋白β链N末端缬氨酸残基形成的稳定的化合物。在体内，血红蛋白一旦与葡萄糖接触，可发生非酶性的糖基化作用，糖基化程度取决于蛋白质与糖接触的时间及糖的浓度。初期阶段先形成一种不稳定的席夫碱(HbA1c前体)，糖化血红蛋白前体经过Amadori重排形成HbA1c，这个酮结构的形成过程是缓慢不可逆的，且贯穿于红细胞平均寿命的始终。值得一提的是，糖化血红蛋白前体在体内始终存在，且HbA1c前体会导致很多针对HbA1c的检测方法产生的结果出现较大的误差。同时，体内的糖基化血红蛋白不止HbA1c一种。总糖化血红蛋白(酮胺血红蛋白，GHb)包括HbA1a(HbA1a1，HbA1a2)、HbA1b、HbA1c等，是所有糖基化的血红蛋白。HbA1a1的N-末端可连接1，6-二磷酸果糖，HbA1a2可与葡萄糖-6-磷酸连接。HbA1c与GHb呈一定比例(HbA1c占GHb的60％)，且HbA1c在糖尿病诊断上最具代表性(每1％的HbA1c变化约等于2mmol/L的血糖变化)。HbA1c不仅可以反映血糖控制、治疗达标等指标，它也在糖尿病预测、诊断、愈后判定上有重要的价值。与空腹血糖(FPG)和空腹葡萄糖耐量测试(OGTT)这两个糖尿病诊断“白金指标”相比，HbA1c有几个优势：方便(HbA1c的检测可以在一天中的任何时候进行且不需要特别的准备，如饮食或禁食)，更好的预分析稳定性(在适当的采血管中收集时，HbA1c是稳定的)以及较小的干扰(来自于其他并发症，血红蛋白变异体和糖化血红蛋白前体的影响较小)。糖化血红蛋白能准确反应患者长期的血糖控制水平，也是监测糖尿病发展的重要指标。同时，糖化血红蛋白有助于人们认识糖尿病并发症并指导患者控制血糖。HbA1c作为糖尿病的相关检测指标之一，多年来已被用作患者监测并控制血糖的一大重要标准，并在重要的诊疗决策中发挥作用，如胰岛素治疗的开始。从1988年到2004年的8项研究中，全球各大实验室分析了HbA1c与糖尿病相关的并发症的联系，并报告说HbA1c和由糖尿病引发的视网膜相关疾病的相联关系与FPG的相关结果基本一致。HbA1c也与由糖尿病引发的血管炎症密切相关。美国糖尿病协会(ADA)在其2010年发布的指南中提出：所有糖尿病患者每年应该至少做两次常规糖化血红蛋白检测。在糖尿病诊疗过程中，单纯依赖空腹血糖的结果来监测糖尿病患者情况是不够的，虽然目前HbA1c的检测费用较高，但其在并发症的预防上相较于空腹血糖有一定的优势，所以将糖化血红蛋白与血糖进行联合检测对糖尿病的诊疗及预防具有重要意义。在上世纪90年代，英美等西方国家便对糖尿病进行了大规模临床病理和生理学的研究，科学家们发现糖尿病并发症的减少和糖化血红蛋白占总血红蛋白百分比的降低有关。近年来，美国糖尿病协会(ADA)和国际临床化学协会(IFCC)致力于用一致性、标准化、可参比的方法检测糖化血红蛋白。目前，国际上以HbA1c的百分比含量作为其检测结果。ADA在2010年发布的糖尿病诊断指南中指出，HbA1c可以用来诊断糖尿病，并以HbA1c/总血红蛋白(浓度比)≥6.5％为糖化血红蛋白检测cutoff值。HbA1c检测将简化糖尿病诊断过程，并在一定程度上实现糖尿病的早期诊断。目前，临床和实验室使用的HbA1c检测方法有很多种，大体可以基于原理分为两种类型：(1)基于HbA1c和非糖化血红蛋白的电荷不同，主要方法有离子交换法和电泳法；(2)基于HbA1c和非糖化血红蛋白的结构不同，这种结构不同主要来自于糖基化位点，主要方法有免疫法和亲和层析法。不同方法检测的物质也有所不同，离子交换法测定的是HbA1c，而亲和层析法测定的是GHb，但这并不意味着亲和层析法不满足检测要求或者亲和层析法性能差。离子交换层析法又包括常见的高效液相色谱(HPLC)，低相液相色谱和手工做柱法。ADA和IFCC均已HPLC的检测结果为糖化血红蛋白检测的标准结果，这种方法虽然较为稳定、有参考价值且线性度好，但也有许多的劣势和缺点：(1)离子交换层析法异受血红蛋白变异体的干扰，因其表面净电荷与HbA1c近似，可能会随HbA1c共洗脱，从而影响测定值；(2)HPLC方法相关的仪器、试剂及耗材昂贵仅适合在大医院推广且HPLC检测有较严苛的环境要求，同时HPLC方法检测时间较长；(3)血红蛋白变异体和糖化血红蛋白前体会干扰HPLC的检测，所以HPLC方法需要经过复杂的预处理步骤以去除血红蛋白变异体和HbA1c前体。电泳法利用不同电荷的血红蛋白样本在电泳凝胶上迁移速度不同的原理检测HbA1c，1969年Rahbar首次发现糖化血红蛋白就是利用的这种方法。电泳法操作复杂，得到结果时间长，现在该方法已很少应用于临床，仅有的一些电泳方法也是较高端的毛细管电泳法。亲和层析法基于硼酸基团对多羟基类物质的吸附能力，亲和层析柱中的硼酸基团首先与糖化血红蛋白糖基化位点的顺位二醇结合，接着从柱子中流出的部分为非糖化的血红蛋白(用紫外-可见吸收光谱)判断浓度，再用Tris、甘露醇、山梨醇等多羟基类物质竞争并洗脱柱子上的糖化血红蛋白，最后从柱子中流出的部分为糖化血红蛋白(GHb)。亲和层析柱法检测糖化血红蛋白在临床上也有所普及，亲和层析柱法不受诸如HbF、HbS、HbC、甲酰化Hb、乙酰化Hb等血红蛋白变异体的影响。糖化血红蛋白前体的存在对其所测定结果无明显影响，血样无需预处理去除糖化血红蛋白前体。但同时，亲和层析柱法的填料昂贵、操作复杂并且得到结果所需要的时间较长。免疫法基于抗体-抗原特异性结合的原理，又有多种不同的应用形式，主要包括：(1)胶乳凝集法，在全自动生化分析仪上得到HbA1c的百分比结果，适合大型医院检验科，但该方法易受葡萄糖、三酰甘油等干扰；(2)免疫比浊法，在试剂盒中得到HbA1c的百分比结果，适合有快速诊断需求的科室和家庭，但该方法线性范围小、易受血红蛋白变异体和HbA1c前体的干扰；(3)金标免疫渗滤法，精确度差，很少有应用；(4)侧向免疫层析试纸条，以荧光量子点/荧光微球/金纳米颗粒为信号载体，以检测线和质控线的信号为检测结果，适合有快速诊断需求的科室和家庭，但同样该方法线性范围小、易受血红蛋白变异体和HbA1c前体的干扰；(5)化学发光法，该方法同样以发光物的发光强度为检测结果，灵敏度、准确度高，但成本昂贵，需要整套的仪器和专用试剂。2012年ADA发表声明，由于目前针对糖化血红蛋白的床旁检测(POCT)快速诊断试纸条尚缺乏重复性和一致性不能用于精确定量检测HbA1c。针对HbA1c的方法学研究已经有很多年，但我们发现亟需要一种准确、快速的糖化血红蛋白检测方法，既可满足糖化血红蛋白检测的国际标准，又可突破现有方法的局限，同时实现准确度、线性范围、床旁诊断(POCT)等方面的需求。
技术实现思路
鉴于上述现有检测技术的不足之处，本专利技术的目的在于提供糖化血红蛋白荧光亲和免疫层析检测试剂盒，旨在解决现有技术中糖化血红蛋白检测不能同时满足快速诊断要求和准确性要求的问本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种糖化血红蛋白荧光亲和免疫层析检测试剂盒，其特征在于，所述糖化血红蛋白荧光亲和免疫层析检测试剂盒包括：稀释液，所述稀释液包括铵根离子化合物、氯化镁和叠氮钠及溶剂；荧光免疫微球溶液，所述荧光免疫微球溶液包括荧光免疫微球和微球保存液；荧光亲和免疫层析试纸条，所述荧光亲和免疫层析试纸条包括底板、样品垫、硝酸纤维素膜(有硼酸亲和层析区和质控线)和吸水纸。

【技术特征摘要】
1.一种糖化血红蛋白荧光亲和免疫层析检测试剂盒，其特征在于，所述糖化血红蛋白荧光亲和免疫层析检测试剂盒包括：稀释液，所述稀释液包括铵根离子化合物、氯化镁和叠氮钠及溶剂；荧光免疫微球溶液，所述荧光免疫微球溶液包括荧光免疫微球和微球保存液；荧光亲和免疫层析试纸条，所述荧光亲和免疫层析试纸条包括底板、样品垫、硝酸纤维素膜(有硼酸亲和层析区和质控线)和吸水纸。2.根据权利要求1所述的糖化血红蛋白荧光亲和免疫层析检测试剂盒，其特征在于，所述稀释液为水、季铵盐类、氢氧化铵、氯化镁和叠氮钠中的一种或几种混合物，稀释液的pH为6.5-10，其中季铵盐类的浓度为0.5-25g/L，氯化镁的浓度为0.5-10g/L，叠氮钠的浓度为0.1-0.5g/L。3.根据权利要求1所述的糖化血红蛋白荧光亲和免疫层析检测试剂盒，其特征在于，所述荧光免疫微球由共价化学偶联、静电吸附和溶胀掺杂中的一种或多种方法制备而成；所述荧光免疫微球固含量为0.1-1wt％。4.根据权利要求1所述的糖化血红蛋白荧光亲和免疫层析检测试剂盒，其特征在于，所述微球保存液为水、碳酸盐类、甘氨酸、大分子蛋白类和叠氮钠中的一种或几种混合物，其中碳酸盐类的浓度为0.001-0.05mol/L，甘氨酸的浓度为0.5-5g/L，大分子蛋白类的浓度为0.5-10g/L，叠氮钠的浓度为0.1-0.5g/L。5.根据权利要求1所述的糖化血红蛋白荧光亲和免疫层析检测试剂盒，其特征在于，所述荧光亲和免疫层析试...

【专利技术属性】
技术研发人员：张宇，王建国，韩国志，
申请(专利权)人：南京东纳生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32