基于纳米孔的体外HIV蛋白酶检测仪器及方法技术

本发明专利技术公开了一种基于纳米孔的体外HIV蛋白酶检测仪器及方法，所述检测仪器包括血样/体液分离芯片（1）、微流控芯片（2）、纳米孔检测电路系统（3）和系统采集控制系统（4）；血样/体液注入口（101）接收血样/体液样本，流入混合通道（103）与裂解通道（102）流入的裂解液混合，混合溶液经过过滤膜（104）后，大分子样品被过滤并通过流入废液池（106）；没有被过滤掉的HIV蛋白酶（205）小分子穿过过滤膜流入到分离后样品流出接口（105），与预先加入的靶蛋白（202）混合反应，两个短片段（206，207）产生过孔信号，计算得出HIV蛋白酶的含量，并最终显示到电脑终端或者手机终端。

In vitro HIV protease detection instrument and method based on nanopore

【技术实现步骤摘要】
基于纳米孔的体外HIV蛋白酶检测仪器及方法
本专利技术属于生物检测
，具体涉及一种基于纳米孔的体外HIV蛋白酶检测仪器及方法。
技术介绍
获得性免疫缺陷综合征(acquiredimmunodeficiencysyndrome,AIDS)又称艾滋病是由人类免疫缺陷病毒(humanimmunodeficiencyvirus,HIV)感染所致的一类高死亡率的传染性疾病。目前全球范围AIDS的医疗对策是尽早发现、早治疗以预防传播，新的联合抗病毒疗法可以让患者长时间处于潜伏期而不发病，但迄今在AIDS的诊断和治疗领域尚存在严重问题与不足。HIV蛋白酶是HIV成熟、复制过程中的关键酶，它通过切割病毒翻译的Gag、Gag-Pol聚蛋白前体使其成为成熟的具有感染性的病毒颗粒，在HIV整个生命循环过程中具有极其重要的作用，近几年已成为抗HIV药物研发的主要靶位之一。因此，研究HIV蛋白酶的活性、结构及功能，对阐明AIDS的发生机制，改进AIDS诊治手段等具有重要意义。HIV蛋白酶研究的关键前提技术是要建立快速准确的活性检测系统，但至今国内外尚无令人满意的研究报道和相关设备。近几年，随着纳米材料、光学、电学等领域科技的发展和相互融合，通过纳米孔技术进行生物样本中的单分子检测已逐步成为可能，基于生物纳米孔的HIV蛋白酶检测也有相应报导。但生物纳米孔由于其自身稳定性差，贮藏有效期短等问题，研究人员将研究方向转向了用固态纳米孔取代生物纳米孔的方法。但低于2.5nm固态纳米孔的加工技术和固态纳米孔信噪比差等技术难题一直没有解决。基于上述技术难题，本申请人前期研发了一种检测工艺，初步可以满足现实检测需要，但用于测试HIV蛋白酶存在两个方面的问题：(1)所使用的固态纳米孔加工包括FIB加工技术和电击穿法加工技术，FIB加工技术加工精度高，但所能加工的最小尺寸为5nm；电击穿法加工技术可以加工2.5nm以上的纳米孔，但加工时间长，容易形成多孔。均不适用于我们所要求的1-2nm的固态纳米孔加工。(2)固态纳米孔由于本身薄膜材料的介电常数较大，进而其构建的固态纳米孔测试体系的电容较大，形成较大的噪声，不能满足HIV蛋白酶测试系统的信噪比要求。测试数据：10um*10um窗口的氮化硅(氮化硅的信噪比要优于石墨烯)纳米孔，孔径为1.5nm，孔长(膜厚)为10nm，在钳位电压为100mV的情况下，其测量噪声远大于50pA，掩盖了HIV蛋白酶剪切后蛋白片段所产生的信号(在该系统下，小片段的阻塞信号小于50pA)。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种基于纳米孔的体外HIV蛋白酶检测仪器及方法，通过本专利所描述的仪器及方法，能够通过采集微量血样/体液，检测出携带HIV病毒人员的HIV蛋白酶含量，尤其能够检测零窗口期的HIV蛋白酶含量，既能实现疑似HIV感染人群的HIV病毒感染情况检测，又能用于抗HIV药品的药效检测，适用于医院诊断，个人检测和药品研究等领域。依据本专利技术的第一方面，提供一种基于纳米孔的体外HIV蛋白酶检测仪器，其包括血样/体液分离芯片1、集成了纳米孔及存储了检测试剂的微流控芯片2、纳米孔检测电路系统3和系统采集控制系统4；血样/体液分离芯片1的血样/体液注入口101接收移液枪或者自动进样机加入的血样/体液样本，流入混合通道103与裂解通道102流入的裂解液混合，实现细胞裂解，混合溶液经过过滤膜104后，大分子样品被过滤并通过流入废液池106；没有被过滤掉的HIV蛋白酶205等小分子穿过过滤膜流入到分离后样品流出接口105，并经接口211流入到纳米孔上层溶液通道213，与预先加入的靶蛋白202混合反应，将靶蛋白剪切为两个短片段206，207，该短片段在纳米孔检测电路3的电场作用下穿过纳米孔，产生过孔信号，最终通过系统采集控制装置4计算得出HIV蛋白酶的含量，并最终显示到电脑终端或者手机终端。其中，固态纳米孔201为氮化硅纳米孔和石墨烯纳米孔，纳米孔孔径为1nm-2nm。进一步地，纳米孔芯片安装在集成了纳米孔及存储了检测试剂的微流控芯片2中，并由微流道系统将纳米孔两侧分为两个腔室。检测电路3所检测到的电流信号为纳米孔的背景电流信号203和未被剪切的靶蛋白/蛋白长链所产生的过孔电流信号204。血样/体液前处理芯片留有用户加入待测样品(血样/体液)的加样口101和裂解液注入口102，用户通过该入口加样；加入的样品在入口后方的103S型管道中混合反应，实现样品的细胞裂解。更进一步地，裂解后的溶液经过过滤膜104，滤掉大分子成分并直接通过废液池接口106流入废液池，而未被滤掉的包含由HIV蛋白酶的小分子溶液通过接口105流入到纳米孔检测芯片2。微流控芯片的流道接口211与前处理芯片流出接口105连接，接收HIV蛋白酶样品溶液。优选地，芯片的最中间部分安装有加工有4个纳米孔的纳米孔芯片201，纳米孔的孔径尺寸为1-2nm，该芯片将缓冲溶液分为上下层溶液，上层溶液固定在210微针内，与纳米孔芯片微接触，接触面积小于5um2。每个微针内部嵌入一个电极，分别与下层溶液的公共电极构成4个纳米孔检测电路电极对，电极连接到芯片外沿的金手指电路，进而在芯片插入检测电路3时与系统电气连接。依据本专利技术技术方案的第二方面，提供一种1-2nm固态纳米孔加工的方法，使得HIV蛋白酶检测的特异性底物所产生的信号量能被固态纳米孔检测出来。其具体为提供一种使用上述的基于纳米孔的体外HIV蛋白酶检测仪器的方法，包括以下步骤：步骤1、固态纳米孔加工；步骤2、提升固态纳米孔信噪比；其中采用基于FIB和电击穿法结合来加工1-2nm固态纳米孔，具体加工步骤如下：(1)准备外观尺寸为5mm*5mm*300um的开窗为10um*10um的氮化硅纳米薄膜；(2)采用FIB(聚焦离子束)的Ga束在血样/体液分离芯片上加工200nm的纳米孔；(3)准备石墨烯薄膜，将石墨烯薄膜固定在基片上，并在石墨烯薄膜上涂一层PMMA；(4)去除石墨烯生产的Cu基底；(5)将PMMA/石墨烯转移到集成了纳米孔及存储了检测试剂的微流控芯片中加工好的氮化硅芯片上，完全覆盖步骤(2)中加工的200nm纳米孔；(6)烘干加热，加固石墨烯薄膜与氮化硅基片的结合力；(7)使用丙酮去除PMMA，最终形成石墨烯纳米孔薄膜；(8)将制备好的石墨烯薄膜芯片放置于微流道芯片上，并注入缓冲液，在相应缓冲液中加入Ag/AgCl电极；(9)连接电打孔设备，并开启打孔装置，将目标设置到1-2nm范围，点击开始打孔；(10)待打孔完成后，采用电打孔设备等源表测试纳米孔的IV曲线，得到I-V曲线图，确定纳米孔加工完成。与现有技术相比较，本专利技术的有益效果为：(1)构建了HIV蛋白酶的固态纳米孔检测方法及仪器；(2)提供了一种HIV感染情况的零窗口期检测方案；(3)为治疗艾滋病的药物药效治疗提供了一种监测工具。本专利技术申请与现行技术比对有如下特征1、利用纳米材料、光学、电学等领域科技的发展和相互融合，通过纳米孔技术进行生物样本中的单分子检测；纳米孔技术无需标记放大等处理，通过直接读取待测物质经过纳米孔时的光电信号进行分析，实现对待测物的直接、高灵敏度的实时在线检测分析。2、构建了完整的可供使用的HIV蛋白酶检测仪和方法。其与现有的几种常用本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于纳米孔的体外HIV蛋白酶检测仪器，其包括血样/体液分离芯片(1)、集成了纳米孔及存储了检测试剂的微流控芯片(2)、纳米孔检测电路系统(3)和系统采集控制系统(4)；血样/体液分离芯片(1)的血样/体液注入口(101)接收移液枪或者自动进样机加入的血样/体液样本，流入混合通道(103)与裂解通道(102)流入的裂解液混合，实现细胞裂解，混合溶液经过过滤膜(104)后，大分子样品被过滤并通过流入废液池(106)；没有被过滤掉的HIV蛋白酶(205)小分子穿过过滤膜流入到分离后样品流出接口(105)，并经接口(211)流入到纳米孔上层溶液通道(213)，与预先加入的靶蛋白(202)混合反应，将靶蛋白剪切为两个短片段(206、207)，该短片段在纳米孔检测电路(3)的电场作用下穿过纳米孔，产生过孔信号，最终通过系统采集控制装置(4)计算得出HIV蛋白酶的含量，并最终显示到电脑终端或者手机终端。

【技术特征摘要】
1.一种基于纳米孔的体外HIV蛋白酶检测仪器，其包括血样/体液分离芯片(1)、集成了纳米孔及存储了检测试剂的微流控芯片(2)、纳米孔检测电路系统(3)和系统采集控制系统(4)；血样/体液分离芯片(1)的血样/体液注入口(101)接收移液枪或者自动进样机加入的血样/体液样本，流入混合通道(103)与裂解通道(102)流入的裂解液混合，实现细胞裂解，混合溶液经过过滤膜(104)后，大分子样品被过滤并通过流入废液池(106)；没有被过滤掉的HIV蛋白酶(205)小分子穿过过滤膜流入到分离后样品流出接口(105)，并经接口(211)流入到纳米孔上层溶液通道(213)，与预先加入的靶蛋白(202)混合反应，将靶蛋白剪切为两个短片段(206、207)，该短片段在纳米孔检测电路(3)的电场作用下穿过纳米孔，产生过孔信号，最终通过系统采集控制装置(4)计算得出HIV蛋白酶的含量，并最终显示到电脑终端或者手机终端。2.根据权利要求1所述的基于纳米孔的体外HIV蛋白酶检测仪器，其特征在于，固态纳米孔(201)为氮化硅纳米孔和石墨烯纳米孔，纳米孔孔径为1nm-2nm。3.根据权利要求1所述的基于纳米孔的体外HIV蛋白酶检测仪器，其特征在于，纳米孔芯片安装在集成了纳米孔及存储了检测试剂的微流控芯片(2)中，并由微流道系统将纳米孔两侧分为两个腔室。4.根据权利要求2所述的基于纳米孔的体外HIV蛋白酶检测仪器，其特征在于，检测电路(3)所检测到的电流信号为纳米孔的背景电流信号(203)，未被剪切的靶蛋白/蛋白长链所产生的过孔电流信号(204)，剪切后的短蛋白A(206)和剪切后的短蛋白B(207)所产生的电流过孔信号(208)和(209)。5.根据权利要求1所述的基于纳米孔的体外HIV蛋白酶检测仪器，其特征在于，血样/体液前处理芯片留有用户加入待测样品的加样口(101)和裂解液注入口(102)，用户通过该入口加样；加入的样品在入口后方的103S型管道中混合反应，实现样品的细胞裂解。6.根据权利要求5所述的基于纳米孔的体外HIV蛋白酶检测仪器，其特征在于，裂解后的溶液经过过滤膜(104)，滤掉大分子成分并直接通过废液池接口(1...

【专利技术属性】
技术研发人员：王德强，方绍熙，谢婉谊，王亮，周硕，何石轩，殷博华，陆文强，周大明，翁婷，王赟姣，
申请(专利权)人：中国科学院重庆绿色智能技术研究院，
类型：发明
国别省市：重庆,50