一种P物质诱导的过敏性哮喘动物模型的构建方法和筛选药物的方法技术

本发明专利技术公开了一种P物质诱导的过敏性哮喘动物模型的构建方法和筛选药物的方法，1)将P物质用生理盐水配制成浓度为30μg/mL的P物质致敏溶液；2)在第1天给小鼠通过雾化吸入4mL的P物质致敏溶液激发哮喘，吸入时间为20min；3)间隔一天重复上述步骤2)操作，即在第3、5、7天重复步骤2)操作；4)在第7天雾化吸入激发哮喘结束后，在24小时内测定小鼠肺功能相关指标，经过数据分析符合哮喘动物模型指标，即说明模型成功构建。本发明专利技术构建方法操作简单，不需要麻醉。采用上述过敏性哮喘动物模型，动物反应性好，适合研究过敏性哮喘发生过程中体内炎症因子水平的变化及信号传递的通路，可用于筛选发现新的治疗哮喘的药物等研究。

The method of building an animal model of allergic asthma induced by substance P and the method of screening drugs

【技术实现步骤摘要】
一种P物质诱导的过敏性哮喘动物模型的构建方法和筛选药物的方法
本专利技术属于医药
，涉及一种动物模型构建方法，尤其是一种P物质诱导的过敏性哮喘动物模型的构建方法和筛选药物的方法。
技术介绍
过敏性哮喘是由多种细胞特别是肥大细胞、嗜酸性粒细胞和T淋巴细胞参与的慢性气道炎症，在易感者中此种炎症可引起反复发作的喘息、气促、胸闷和(或)咳嗽等症状，多在夜间和(或)凌晨发生，气道对多种刺激因子反应性增高。但症状可自行或经治疗缓解。近十余年来，美国、英国、澳大利亚、新西兰等国家哮喘患病率和死亡率有上升趋势，全世界约有一亿哮喘患者，已成为严重威胁公众健康的一种主要慢性疾病。中国哮喘的患病率约为1％，儿童可达3％，据测算全国约有1千万以上哮喘患者。当前经典理论一般认为过敏性哮喘是致敏原吸入后和支气管粘膜肥大细胞表面受体上的特异性IgE结合，导致肥大细胞脱颗粒释放活性物质如组胺、白三烯等引起支气管平滑肌收缩所致。肥大细胞同时也释放具有趋化活性的物质，促使炎症细胞主要是嗜酸性白细胞聚集到肺部支气管参与过敏性炎症过程。类过敏反应由于与Ⅰ型过敏反应症状相似，机制与肥大细胞或嗜碱性粒细胞脱颗粒、激活补体系统，引起释放组胺或其他血管活性因子等生物活性介质有关，常被混称为Ⅰ型过敏反应，但两者却有不同的发生机制。通常类过敏反应起病比较急，短期暴露于致敏原下即迅速出现，不需要提前接触抗原的致敏过程，抗体或淋巴细胞不参与反应过程，无需IgE等免疫球蛋白介导，患者血清的IgE浓度也未见升高，具有病情危急的特点，首次给药即可发生严重ADR及休克。P物质是一种广泛分布于细神经纤维内的神经肽。当神经末梢收到刺激时，便释放P物质于其特异性受体NK1结合。P物质不需要IgE的参与，可通过MRGPRX2直接激活肥大细胞，引起胞内Ca2+动员和细胞脱颗粒，释放组胺。同时还具有对单核细胞，嗜酸性粒细胞的趋化作用，调节细胞因子的产生。故P物质是一种潜在的引起过敏性性哮喘的神经肽。近年来，临床上遇到大量有哮喘症状，但血清IgE并未升高的患者。对其血清中P物质进行检测，发现有着明显升高。因此，建立一种不经过IgE途径，以P物质为致敏物质的哮喘模型迫在眉睫。
技术实现思路
为了克服上述现有技术的缺点，本专利技术的目的在于提供一种P物质诱导的过敏性哮喘动物模型的构建方法和筛选药物的方法，通过该方法可以成功构建过敏性哮喘动物模型，该动物模型无需二次接触致敏物质，不经过IgE介导，首次接触即可引发哮喘。为了达到上述目的，本专利技术采用以下技术方案予以实现：本专利技术公开的一种P物质诱导的过敏性哮喘动物模型的构建方法，包括以下步骤：1)将P物质用生理盐水配制成浓度为10～90μg/mL的P物质致敏溶液；2)在第1天给小鼠通过雾化吸入1～6mL的P物质致敏溶液激发哮喘，吸入时间为20min；3)间隔一天重复上述步骤2)操作；4)在最后一次的雾化吸入激发哮喘结束后，在24小时内测定小鼠肺功能相关指标，肺泡灌洗液中细胞因子含量，肺泡灌洗液中嗜酸性粒细胞数量，并取肺组织切片，HE染色，分析数据观察可见：小鼠气道高反应性，肺泡灌洗液中细胞因子含量升高，肺泡灌洗液中嗜酸性粒细胞数量增加，HE染色可见明显的炎性浸润，即成功构建P物质诱导的过敏性哮喘动物模型。优选地，所述P物质的纯度≥97％。优选地，所述小鼠为6～8周近交系C57BL/6。优选地，构建的P物质诱导的过敏性哮喘动物模型的IgE未升高。本专利技术还公开了利用上述的构建方法构建得到的P物质诱导的过敏性哮喘动物模型筛选治疗哮喘药物的方法，包括以下步骤：(1)设置待测药物组、正常对照组、生理盐水组；(2)对待测药物组和生理盐水组采用P物质诱导的过敏性哮喘动物模型激发，正常对照组以生理盐水雾化激发；(3)待测药物组和生理盐水组在每次用所述P物质诱导的过敏性哮喘动物模型激发前1小时，灌胃给药；正常对照组在每次用生理盐水雾化激发前1小时，灌胃等量生理盐水；每次激发结束后，24小时内测定小鼠各项肺功能指标，肺泡灌洗液中细胞因子含量，肺泡灌洗液中嗜酸性粒细胞数量，并取肺组织切片，HE染色；(4)分析步骤(3)得到的数据，对待测药物的治疗效果进行评价。优选地，分析步骤(4)获得的数据：若正常对照组记录的数据没有升高，而生理盐水组记录的数据有所升高，表明过敏性哮喘动物模型制备成功；若待测药物组记录的数据较正常对照组记录的数据受到抑制，则表示待测药物具备治疗哮喘的作用。与现有技术相比，本专利技术具有以下有益效果：本专利技术提供了一种过敏性哮喘动物模型的制备方法及一种筛选治疗P物质诱导的过敏性哮喘的药物的方法。本专利技术所述过敏性哮喘动物模型的制备方法操作简单，耗时短，无需经过IgE途径，通过直接刺激肥大细胞，即可引发哮喘。评价模型成功与否及药物效果的方法，从组织形态，生理功能，细胞类型等多方面，全面且精确的做出了评价。提供了一种全新的动物模型，也为哮喘发病机理研究、筛选治疗哮喘的药物提供一种新途径。采用本专利技术所述制备方法得到的过敏性哮喘动物模型，动物反应性好，适合研究过敏性哮喘发生过程中体内炎症因子水平的变化及信号传递的通路，可用于筛选发现新的治疗哮喘的药物等研究。附图说明图1为实施例1中第3、7、11、15天喷雾结束后，flexiVent系统测定不同浓度模型鼠和正常鼠肺功能参数Rn(主气道阻力)的比较图；其中图1中A为第3天测量结果；B为第7天测量结果；C为第11天测量结果；D为第15天测量结果横坐标为乙酰胆碱浓度，纵坐标为相应的压力；图2为实施例1中第15天喷雾结束后，模型鼠和正常鼠肺组织切片HE染色比较，可见模型鼠肺组织有明显的炎性浸润及气道重塑；其中图2中A为空白对照组，B为P物质低浓度组，C为P物质中浓度组，D为P物质高浓度组，E为MRGPRB2基因敲除组；图3为实施例1中第15天喷雾结束后，采用ELISA法对各组小鼠血清中IgE含量的测定；图4为实施例3中每次喷雾结束后，flexiVent系统测定各组动物肺功能参数Rn(主气道阻力)的比较图；其中，横坐标为乙酰胆碱浓度，纵坐标为相应的压力；图5为实施例3中每次喷雾结束后对各组动物肺泡灌洗液中细胞因子的测定；图A-E分别为IL-4，MCP-1，IL-5，IL-13和TNF-α；图6为实施例3中每次喷雾结束后对各组动物肺组织切片HE染色；其中图A为空白对照组，B为模型对照组，C为待测药物组；。具体实施方式为了使本
的人员更好地理解本专利技术方案，下面将结合本专利技术实施例中的附图，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分的实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本专利技术保护的范围。需要说明的是，本专利技术的说明书和权利要求书及上述附图中的术语“第一”、“第二”等是用于区别类似的对象，而不必用于描述特定的顺序或先后次序。应该理解这样使用的数据在适当情况下可以互换，以便这里描述的本专利技术的实施例能够以除了在这里图示或描述的那些以外的顺序实施。此外，术语“包括”和“具有”以及他们的任何变形，意图在于覆盖不排他的包含，例如，包含了一系列步骤或单元的过程、方法、系统、产品或设备不必限于清楚地本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种P物质诱导的过敏性哮喘动物模型的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：1)将P物质用生理盐水配制成浓度为10～90μg/mL的P物质致敏溶液；2)在第1天给小鼠通过雾化吸入1～6mL的P物质致敏溶液激发哮喘，吸入时间为20min；3)间隔一天重复上述步骤2)操作；4)在最后一次的雾化吸入激发哮喘结束后，在24小时内测定小鼠肺功能相关指标，肺泡灌洗液中细胞因子含量，肺泡灌洗液中嗜酸性粒细胞数量，并取肺组织切片，HE染色，分析数据观察可见：小鼠气道高反应性，肺泡灌洗液中细胞因子含量升高，肺泡灌洗液中嗜酸性粒细胞数量增加，HE染色可见明显的炎性浸润，即成功构建P物质诱导的过敏性哮喘动物模型。

【技术特征摘要】
1.一种P物质诱导的过敏性哮喘动物模型的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：1)将P物质用生理盐水配制成浓度为10～90μg/mL的P物质致敏溶液；2)在第1天给小鼠通过雾化吸入1～6mL的P物质致敏溶液激发哮喘，吸入时间为20min；3)间隔一天重复上述步骤2)操作；4)在最后一次的雾化吸入激发哮喘结束后，在24小时内测定小鼠肺功能相关指标，肺泡灌洗液中细胞因子含量，肺泡灌洗液中嗜酸性粒细胞数量，并取肺组织切片，HE染色，分析数据观察可见：小鼠气道高反应性，肺泡灌洗液中细胞因子含量升高，肺泡灌洗液中嗜酸性粒细胞数量增加，HE染色可见明显的炎性浸润，即成功构建P物质诱导的过敏性哮喘动物模型。2.根据权利要求1所述的P物质诱导的过敏性哮喘动物模型的构建方法，其特征在于，所述P物质的纯度≥97％。3.根据权利要求1所述的P物质诱导的过敏性哮喘动物模型的构建方法，其特征在于，所述小鼠为6～8周近交系C57BL/6。4.根据权利要求1所述的P物质诱导的过敏性哮喘动物模型的构建方法，其特征在于，构建的P物质诱导的过敏性哮喘...

【专利技术属性】
技术研发人员：王楠，贺浪冲，贺怀贞，王程，王珏，张永竟，
申请(专利权)人：西安交通大学，
类型：发明
国别省市：陕西,61