使用CRISPR/CAS系统以可选方式进行基因驱动在植物中赋予对双生病毒的抗性技术方案

赋予植物或植物细胞双生病毒抗性的材料和方法，特别是使用CRISPR/Cas或CRISPR/Cpf1系统赋予对双生病毒抗性的材料和方法。描述了材料和方法以在双生病毒基因组中的双链断裂处插入序列。

Using CRISPR/CAS system to selectively drive genes to confer resistance to geminiviruses in plants

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】使用CRISPR/CAS系统以可选方式进行基因驱动在植物中赋予对双生病毒的抗性
公开了用于赋予植物对双生病毒的抗性的材料和方法，并且特别涉及使用位点特异性核酸酶(SDN)系统赋予植物对双生病毒的抗性的材料和方法。背景双生病毒是主要的植物病原体，导致全世界显著的作物损失(Mansooretal.TrendsPlantSci.8：128-134，2003)。双生病毒是由两个部分地组装的二十面体连接在一起的颗粒组成的小的单链环状DNA植物病毒。双生病毒基因组的大小在2.5到3.0kb之间。由于宿主范围大，双生病毒能够在多种植物中引起疾病，包括来自单子叶植物(例如玉米和小麦)和双子叶植物(例如番茄和木薯)的物种。双生病毒的实例包括卷心菜叶卷曲病毒、番茄金花叶病毒、豆黄矮病毒、非洲木薯花叶病毒、小麦矮缩病毒、芒草条纹乳房病毒、烟草黄矮病毒、番茄黄叶卷曲病毒、豆金花叶病毒、甜菜卷曲病毒、玉米条纹病毒和番茄假卷曲病毒。需要通过生物学和生态学上安全的策略在植物中提供对双生病毒的抗性，即同时通过“基因驱动”作用使任何遗传修饰的双生病毒最小化释放到野外。
技术实现思路
本公开内容部分基于用于增加植物对双生病毒的抗性的有效基因组工程方法的发现。本文提供的方法利用称为成簇的规律间隔短回文重复序列(CRISPR)/CRISPR相关(Cas)系统的原核适应性免疫系统，其包括称为Cas9的核酸酶。作为替代，在本文描述的任何方面和实施方案中，可以使用Cpf1和NgAgo代替Cas9。在一个方面是产生对双生病毒感染具有增加的抗性的植物细胞的方法。该方法包括将植物细胞引入基因组：(i)第一核酸，其包含编码位点特异性核酸酶蛋白的序列，其中所述蛋白可以是CRISPR(系统)相关的位点特异性核酸酶(SDN)蛋白，优选Cas蛋白，例如Cas9或Cas10，或者Cpf1蛋白，并且其中所述蛋白能够在双生病毒基因组中在靶位点处引入双链断裂，并且其中所述第一核酸进一步包含指导所述蛋白在所述植物细胞中表达的启动子，或者所述蛋白的表达由(ii)或(iii)的启动子指导，(ii)第二核酸，其包含编码一个或多个CRISPRRNA(crRNA)的序列，其中所述一个或多个crRNA中的每一个包含与双生病毒基因组内的一个或多个靶序列互补的序列，并且其中所述第二核酸进一步包含一个或多个指导所述一个或多个crRNA在所述植物细胞中表达的启动子，或者所述一个或多个crRNA的表达由(i)或(iii)的启动子指导，和(iii)第三核酸，其包含编码一个或多个反式激活crRNA(tracrRNA)的序列，其中所述第三核酸还包含一个或多个指导所述一个或多个tracrRNA在所述植物细胞中表达的启动子，或者所述一个或多个tracrRNA的表达由(i)或(ii)的启动子指导。所述第二和第三核酸可任选地被编码一个或多个单向导RNA(sgRNA)的单一第四核酸替代。所述一个或多个sgRNA中的每一个包含与双生病毒基因组内的一个或多个靶序列互补的序列。所述第四核酸还包含一个或多个指导所述一个或多个sgRNA在所述植物细胞中表达的启动子，或者所述一个或多个sgRNA的表达由(i)的启动子指导。在位点特异性核酸酶蛋白是NgAgo的情况下，第二和第三核酸可以被编码一个或多个DNA分子的单一第四核酸替换。所述一个或多个DNA分子中的每一个包含与双生病毒基因组内的一个或多个靶序列互补的序列，并且一个或多个DNA分子能够将NgAgo引导至所述双生病毒基因组内的所述一个或多个靶序列。所述第四核酸还包含一个或多个指导一个或多个DNA分子在植物细胞中表达的启动子，或者所述一个或多个DNA分子的表达由(i)的启动子指导。所述第一和/或第二和/或第三核酸或所述第一和/或第四核酸还包含左同源臂序列和/或右同源臂序列。每个同源臂序列包含来自双生病毒基因组的核苷酸序列，其与双生病毒靶序列中由所述蛋白引入的双链断裂的靶位点相邻。左同源臂序列和右同源臂序列通过同源重组有效地将它们之间包含的核酸序列在双生病毒靶序列处引入双生病毒基因组中。所述第一、第二和第三核酸或所述第一和第四核酸稳定整合到所述植物细胞的基因组中。另一方面是产生对双生病毒感染具有增加的抗性的植物细胞的方法。该方法包括向植物细胞基因组引入：(i)编码位点特异性核酸酶蛋白的第一核酸序列，其中所述蛋白可以是CRISPR(system)-相关的位点特异性核酸酶蛋白，优选Cas蛋白，例如Cas9或Cas10，或Cpf1蛋白，其中该蛋白能够在双生病毒基因组中在靶位点处引入双链断裂，并且其中所述第一核酸序列与指导所述蛋白在植物细胞中表达的启动子的可操作地连接，或其中所述第一核酸序列与(ii)或(iii)的启动子可操作地连接，(ii)编码CRISPRRNA(crRNA)的第二核酸序列，其中所述crRNA包含与双生病毒基因组内的一个或多个靶序列互补的序列，并且其中所述第二核酸序列与指导crRNA在植物细胞中表达的启动子可操作地连接，或所述第二核酸序列与(i)或(iii)的启动子可操作地连接，和(iii)编码反式激活crRNA(tracrRNA)的第三核酸序列，其中所述第三核酸序列与指导tracrRNA在植物细胞中表达的启动子可操作地连接，或者所述第三核酸序列与(i)或(ii)的启动子可操作地连接。所述第二和第三核酸序列可任选地被编码作为向导RNA(gRNA)的杂合体crRNA/tracrRNA的单一第四核酸序列替换。gRNA包含与双生病毒基因组内的靶序列互补的序列，其中所述第四核酸序列与指导gRNA在植物细胞中表达的启动子可操作地连接，或者所述第四核酸序列与(i)的启动子可操作地连接。在位点特异性核酸酶蛋白是NgAgo的情况下，所述第二和第三核酸可以被编码一个或多个DNA分子的单一第四核酸替换。所述一个或多个DNA分子中的每一个包含与双生病毒基因组内的一个或多个靶序列互补的序列，并且所述一个或多个DNA分子能够将NgAgo引导至双生病毒基因组内的一个或多个靶序列。所述第四核酸还包含一个或多个指导所述一个或多个DNA分子在植物细胞中表达的启动子，或者所述一个或多个DNA分子的表达由(i)的启动子指导。所述第一和/或第二和/或第三核酸或所述第一和/或第四核酸还包含左同源臂序列和右同源臂序列，每个同源臂序列包含来自双生病毒基因组的核苷酸序列，其与双生病毒靶序列中由所述蛋白引入的双链断裂的靶位点相邻。左同源臂序列和右同源臂序列通过同源重组有效地将它们之间包含的核酸序列在双生病毒靶序列处引入双生病毒基因组中。所述第一、第二和第三核酸或所述第一和第四核酸稳定地整合到所述植物细胞的基因组中。另一方面是产生对双生病毒感染具有增加的抗性的植物细胞的方法。该方法包括向植物细胞的基因组中引入一种核酸分子，其包含：(i)编码位点特异性核酸酶蛋白的第一核酸序列，其中蛋白可以是CRISPR(system)-相关的位点特异性核酸酶蛋白，优选Cas蛋白，例如Cas9或Cas10，或Cpf1蛋白，其中该蛋白能够在双生病毒基因组中在靶位点处引入双链断裂，并且其中所述第一核酸序列与指导所述蛋白在植物细胞中表达的启动子可操作地连接，或所述第一核酸序列与(ii)或(iii)的启动子可操作地连接，(ii本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种产生对双生病毒感染具有增加的抗性的植物细胞的方法，其中该方法包括向植物细胞的基因组中引入：(i)第一核酸，其包含编码成簇的规律间隔短回文重复序列(CRISPR)相关的位点特异性核酸酶蛋白的序列，其中所述蛋白能够在双生病毒基因组中在靶位点处引入双链断裂，且其中所述第一核酸还包含指导所述蛋白在植物细胞中表达的启动子，或所述蛋白的表达由(ii)或(iii)的启动子指导，(ii)第二核酸，其包含编码一个或多个成簇的规律间隔短回文重复序列(CRISPR)RNA(crRNA)的序列，其中所述一个或多个crRNA中的每一个包含与双生病毒基因组内的一个或多个靶序列互补的序列，且其中所述第二核酸还包含一个或多个指导所述一个或多个crRNA在所述植物细胞中表达的启动子，或者所述一个或多个crRNA的表达由(i)或(iii)的启动子指导，和(iii)第三核酸，其包含编码一个或多个反式激活crRNA(tracrRNA)的序列，其中所述第三核酸还包含一个或多个指导所述一个或多个tracrRNA在所述植物细胞中表达的启动子，或所述一个或多个tracrRNA的表达由(i)或(ii)的启动子指导，其中所述第二和第三核酸可任选地被编码一个或多个单向导RNA(sgRNA)的单一第四核酸替换，其中所述一个或多个sgRNA中每一个包含与双生病毒基因组内的一个或多个靶序列互补的序列，并且其中所述第四核酸还包含一个或多个指导所述一个或多个sgRNA在所述植物细胞中表达的启动子，或所述一个或多个sgRNA的表达由(i)的启动子指导，其中所述第一和/或第二和/或第三核酸或所述第一和/或第四核酸还包含左同源臂序列和/或右同源臂序列，每个同源臂序列包含来自双生病毒基因组的核苷酸序列，其与双生病毒靶序列中由所述蛋白引入的双链断裂的靶位点相邻，并且其中左同源臂序列和右同源臂序列通过同源重组有效地将它们之间所含有的核酸序列在双生病毒靶序列处引入双生病毒基因组中，并且其中所述第一、第二和第三核酸或所述第一和第四核酸稳定整合到植物细胞的基因组中。...

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2016.12.20 US 62/436,7921.一种产生对双生病毒感染具有增加的抗性的植物细胞的方法，其中该方法包括向植物细胞的基因组中引入：(i)第一核酸，其包含编码成簇的规律间隔短回文重复序列(CRISPR)相关的位点特异性核酸酶蛋白的序列，其中所述蛋白能够在双生病毒基因组中在靶位点处引入双链断裂，且其中所述第一核酸还包含指导所述蛋白在植物细胞中表达的启动子，或所述蛋白的表达由(ii)或(iii)的启动子指导，(ii)第二核酸，其包含编码一个或多个成簇的规律间隔短回文重复序列(CRISPR)RNA(crRNA)的序列，其中所述一个或多个crRNA中的每一个包含与双生病毒基因组内的一个或多个靶序列互补的序列，且其中所述第二核酸还包含一个或多个指导所述一个或多个crRNA在所述植物细胞中表达的启动子，或者所述一个或多个crRNA的表达由(i)或(iii)的启动子指导，和(iii)第三核酸，其包含编码一个或多个反式激活crRNA(tracrRNA)的序列，其中所述第三核酸还包含一个或多个指导所述一个或多个tracrRNA在所述植物细胞中表达的启动子，或所述一个或多个tracrRNA的表达由(i)或(ii)的启动子指导，其中所述第二和第三核酸可任选地被编码一个或多个单向导RNA(sgRNA)的单一第四核酸替换，其中所述一个或多个sgRNA中每一个包含与双生病毒基因组内的一个或多个靶序列互补的序列，并且其中所述第四核酸还包含一个或多个指导所述一个或多个sgRNA在所述植物细胞中表达的启动子，或所述一个或多个sgRNA的表达由(i)的启动子指导，其中所述第一和/或第二和/或第三核酸或所述第一和/或第四核酸还包含左同源臂序列和/或右同源臂序列，每个同源臂序列包含来自双生病毒基因组的核苷酸序列，其与双生病毒靶序列中由所述蛋白引入的双链断裂的靶位点相邻，并且其中左同源臂序列和右同源臂序列通过同源重组有效地将它们之间所含有的核酸序列在双生病毒靶序列处引入双生病毒基因组中，并且其中所述第一、第二和第三核酸或所述第一和第四核酸稳定整合到植物细胞的基因组中。2.权利要求1的方法，其中左同源臂序列和右同源臂序列之间的核酸序列的大小使得在同源重组进入双生病毒基因组后它防止这种基因组被包装成病毒颗粒，和/或所述双生病毒靶序列是双生病毒基因组中感染植物细胞所必需的序列。3.权利要求1的方法，其中所述第一和第二核酸，第一和第三核酸，第二和第三核酸，第一、第二和第三核酸，或第一和第四核酸被置于单一核酸分子上以引入植物细胞基因组。4.权利要求1的方法，其中在所述植物细胞暴露于双生病毒时，(a)所述位点特异性核酸酶蛋白在双生病毒靶位点处或其附近介导双生病毒基因组中的双链断裂，并且(b)第一和/或第二和/或第三核酸中的一个或多个或第一和/或第四核酸中的一个或多个通过同源重组在双链断裂处插入双生病毒基因组中以形成经修饰的双生病毒；其中所述经修饰的双生病毒不能进行复制、包装、从植物细胞转运或感染植物细胞中的一种或多种。5.权利要求1的方法，其中左同源臂是至少30bp，任选地至少400bp，并且右同源臂是至少30bp，任选地至少400bp。6.权利要求1的方法，其中所述靶序列中包含的序列在Rep蛋白ORF、运动蛋白ORF、外壳蛋白ORF、介导复制起点的发夹区或卫星DNA内。7.权利要求1的方法，其中所述成簇的规律间隔短回文重复序列(CRISPR)相关的位点特异性核酸酶蛋白是Cas蛋白，优选Cas9蛋白或Cpfl蛋白。8.权利要求1的方法，其中一个或多个启动子可响应双生病毒感染而被诱导。9.权利要求1的方法，其中所述一个或多个crRNA或所述一个或多个sgRNA包含与多于一种双生病毒物种的基因组内的一个或多个靶序列互补的序列，或包含与同一双生病毒物种的多于一种的毒株的基因组内的一个或多个靶序列互补的序列。10.权利要求1的方法，其中每个同源臂序列包含与靶序列中由所述蛋白引入的双链断裂的靶位点相邻的核苷酸序列，并且其中所述左同源臂序列和右同源臂序列通过同源重组有效地将它们之间所含有的核酸序列引入多于一种双生病毒物种的基因组中或同一双生病毒物种的多于一种毒株的基因组中。11.权利要求10的方法，其中所产生的植物细胞对多种双生病毒物种的感染具有增加的抗性，或对同一双生病毒物种的多种毒株的感染具有增加的抗性。12.一种用于产生对双生病毒感染具有增加的抗性的植物的方法，其中所述方法包括：(I)通过权利要求1的方法产生具有增加的双生病毒抗性的植物细胞，和(II)从(I)的植物细胞再生植物。13.通过权利要求1的方法产生的植物细胞。14.通过权利要求12的方法产生的植物或植物部分。15.一种载体，包含：(i)第一核酸，其包含编码成簇的规律间隔短回文重复序列(CRISPR)相关的位点特异性核酸酶蛋白的序列，其中所述蛋白能够在在双生病毒基因组中在靶位点处引入双链断裂，且其中所述第一核酸还包含指导所述蛋白在植物细胞中表达的启动子，或所述蛋白的表达由(ii)或(iii)的启动子指导，(ii)第二核酸，其包含编码一个或多个成簇的规律间隔短回文重复序列(CRISPR)RNA(crRNA)的序列，其中所述一个或多个crRNA中每一个包含与所述双生病毒基因组内的一个或多个靶序列互补的序列，且其中所述第二核酸还包含一个或多个指导所述一个或多个crRNA在植物细胞中表达的启动子，或者所述一个或多个crRNA的表达由(i)或(iii)的启动子指导，(iii)第三核酸，其包含编码一个或多个反式激活crRNA(tracrRNA)的序列，其中所述第三核酸还包含一个或多个指导所述一个或多个tracrRNA在植物细胞中表达的启动子，或所述一个或多个tracrRNA的表达由(i)或(ii)的启动子指导(iv)左同源臂序列和/或右同源臂序列，每个同源臂序列包含来自双生病毒基因组的核苷酸序列，该核苷酸序列与双生病毒靶序列中由所述蛋白引入的双链断裂的靶位点相邻，并且其中所述左同源臂序列和右同源臂序列通过同源重组有效地将它们之间所含有的核酸序列在双生病毒靶序列处引入双生病毒基因组中。16.权利要求15的载体，其中左同源臂序列和右同源臂序列之间的核酸序列的大小使得在同源重组进入双生病毒基因组后它防止这种基因组被包装成病毒颗粒，和/或所述双生病毒靶序列是双生病毒基因组中感染植物细胞所必需的序列。17.权利要求15的载体，其中左同源臂是至少30bp，任选地至少400bp，且右同源臂是至少30bp，任选地至少400bp。18.权利要求15的载体，其中靶序列中包含的序列在Rep蛋白ORF、运动蛋白ORF、外壳蛋白ORF、介导复制起点的发夹区或卫星DNA内。19.权利要求15的载体，其中所述成簇的规律间隔短回文重复序列(CRISPR)相关的位点特异性核酸酶蛋白是Cas蛋白，优选Cas9蛋白或Cpfl蛋白。20.权利要求15的载体，其中一个或多个启动子可响应双生病毒感染而被诱导。21.权利要求15的载体，其中所述一个或多个crRNA包含与多于一种双生病毒物种的基因组内的一个或多个靶序列互补的序列，或包含与同一双生病毒物种的多于一种毒株的基因组内的一个或多个靶序列互补的序列。22.权利要求15的载体，其中每个同源臂序列包含与靶序列中由所述蛋白引入的双链断裂的靶位点相邻的核苷酸序列，并且其中所述左同源臂序列和右同源臂序列通过同源重组有效地将在它们之间所含有的核酸序列引入多于一种双生病毒物种的基因组中或同一双生病毒物种的多于一种毒株的基因组中。23.一种载体，包含：(i)第一核酸，其包含编码成簇的规律间隔短回文重复序列(CRISPR)相关的位点特异性核酸酶蛋白的序列，其中所述蛋白能够在双生病毒基因组中在靶位点处引入双链断裂，其中所述第一核酸还包含指导所述蛋白在植物细胞中表达的启动子，或所述蛋白的表达由(ii)的启动子指导，(ii)第二核酸，其编码一个或多个单向导RNA(sgRNA)，其中所述一个或多个sgRNA中的每一个包含与双生病毒基因组内的一个或多个靶序列互补的序列，并且其中所述第二核酸还包含一个或多个指导所述一个或多个sgRNA在植物细胞中表达的启动子，或者所述一个或多个sgRNA的表达由(i)的启动子指导，和(iii)左同源臂序列和/或右同源臂序列，每个同源臂序列包含来自双生病毒基因组的核苷酸序列，该核苷酸序列与双生病毒靶序列中由所述蛋白引入的双链断裂的靶位点相邻，并且其中所述左同源臂序列和右同源臂序列通过同源重组有效地将它们之间所含有的核酸序列在双生病毒靶序列处引入双生病毒基因组中。24.权利要求23的载体，其中所述左同源臂序列和右同源臂序列之间的核酸序列的大小使得在同源重组进入双生病毒基因组后其防止这种基因组被包装成病毒颗粒，和/或所述双生病毒靶序列是双生病毒基因组中感染植物细胞所必需的序列。25.权利要求23的载体，其中左同源臂是至少30bp，任选地至少400bp，且右同源臂是至少30bp，任选地至少400bp。26.权利要求23的载体，其中靶序列中包含的序列在Rep蛋白ORF、运动蛋白ORF、外壳蛋白ORF、介导复制起点的发夹区或卫星DNA内。27.如权利要求23所述的载体，其中所述成簇的规律间隔短回文重复序列(CRISPR)相关的位点特异性核酸酶蛋白是Cas蛋白，优选Cas9蛋白或Cpfl蛋白。28.权利要求23的载体，其中一个或多个启动子可响应双生病毒感染而被诱导。29.权利要求23的载体，其中所述一个或多个sgRNA包含与多于一种双生病毒物种的基因组内的一个或多个靶序列互补的序列，或包含与同一双生病毒物种的多于一种毒株的基因组内的一个或多个靶序列互补的序列。30.权利要求23的载体，其中每个同源臂序列包含与靶序列中由所述蛋白引入的双链断裂的靶位点相邻的核苷酸序列，并且其中所述左同源臂序列和右同源臂序列通过同源重组有效地将在它们之间所含有的核酸序列引入多于一种双生病毒物种的基因组中或同一双生病毒物种的多于一种毒株的基因组中。31.一种对双生病毒感染具有增加的抗性的植物、植物部分或植物细胞，其包含权利要求15或23之一的载体或包含稳定整合到基因组中的：(i)第一核酸，其包含编码成簇的规律间隔短回文重复序列(CRISPR)相关的位点特异性核酸酶蛋白的序列，其中所述蛋白能够在双生病毒基因组中在靶位点处引入双链断裂，且其中所述第一核酸还包含指导所述蛋白在植物细胞中表达的启动子，或所述蛋白的表达由(ii)或(iii)的启动子指导，(ii)第二核酸，其包含编码一个或多个成簇的规律间隔短回文重复序列(CRISPR)RNA(crRNA)的序列，其中所述一个或多个crRNA中的每一个包含与双生病毒基因组内的一个或多个靶序列互补的序列，且其中所述第二核酸还包含一个或多个指导所述一个或多个crRNA在所述植物细胞中表达的启动子，或者所述一个或多个crRNA的表达由(i)或(iii)的启动子指导，和(iii)第三核酸，其包含编码一个或多个反式激活crRNA(tracrRNA)的序列，其中所述第三核酸还包含一个或多个指导所述一个或多个tracrRNA在所述植物细胞中表达的启动子，或所述一个或多个tracrRNA的表达由(i)或(ii)的启动子指导，其中所述第二和第三核酸可任选地被编码一个或多个单向导RNA(sgRNA)的单一第四核酸替换，其中所述一个或多个sgRNA中每一个包含与双生病毒基因组内的一个或多个靶序列互补的序列，并且其中所述第四核酸还包含一个或多个指导所述一个或多个sgRNA在所述植物细胞中表达的启动子，或所述一个或多个sgRNA的表达由(i)的启动子指导，其中所述第一和/或第二和/或第三核酸或所述第一和/或第四核酸还包含左同源臂序列和/或右同源臂序列，每个同源臂序列包含来自双生病毒基因组的核苷酸序列，其与双生病毒靶序列中由所述蛋白引入的双链断裂的靶位点相邻，并且其中所述左同源臂序列和右同源臂序列通过同源重组有效地将它们之间所含有的核酸序列在双生病毒靶序列处引入双生病毒基因组中。32.权利要求31的植物、植物部分或植物细胞，其中所述左同源臂序列和所述右同源臂序列之间的核酸序列的大小使得在同源重组进入双生病毒基因组后其防止所述基因组被包装成病毒颗粒，和/或所述双生病毒靶序列是双生病毒基因组中感染植物细胞所必需的序列。33.权利要求31的植物、植物部分或植物细胞，其中在所述植物、植物部分或植物细胞暴露于双生病毒时，(a)所述位点特异性核酸酶蛋白在双生病毒靶位点处或其附近介导双生...

【专利技术属性】
技术研发人员：A·赫梅尔，D·G·巴特勒姆，
申请(专利权)人：KWS种子欧洲股份公司，
类型：发明
国别省市：德国,DE