一种源于集胞藻的漆酶基因slr1573及在染料脱色中的应用制造技术

本发明专利技术涉及一种源于集胞藻Synechocystis 6803的漆酶基因slr1573及在染料脱色中的应用，属于生物技术领域。该漆酶基因的DNA序列如SEQ ID NO.1所示，编码蛋白质氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明专利技术构建了集胞藻漆酶基因slr1573的原核表达载体，并转化大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)，成功获得表达重组Slr1573的菌株，对重组漆酶粗酶液酶学性质进行了检测，本发明专利技术获得的slr1573漆酶基因获得高效表达，重组漆酶可高效催化孔雀绿等染料脱色。

A Laccase Gene slr1573 Derived from Collector Algae and Its Application in Dye Decolorization

【技术实现步骤摘要】
一种源于集胞藻的漆酶基因slr1573及在染料脱色中的应用
本专利技术涉及一种源于集胞藻Synechocystis6803的漆酶基因slr1573及在染料脱色中的应用，属于生物

技术介绍
漆酶是一种含铜多酚氧化酶，能催化氧化酚类和非酚类芳香化合物成水，属于环保型酶。漆酶催化底物十分广泛，通过形成漆酶－介体系统可进一步扩大底物的作用范围。漆酶资源丰富，按照不同的来源可划分为三类：植物漆酶、动物漆酶和微生物漆酶（包括真菌漆酶和细菌漆酶），最早发现的漆酶是漆树漆酶，来源于动物的漆酶目前报道较少，真菌漆酶是漆酶的主要来源，如白腐菌、子囊菌亚门(Ascomycotina)及半知菌亚门(Deuteromycotina)。随着人们对漆酶的研究，发现细菌中也存在大量的漆酶。目前植物漆酶、真菌漆酶和细菌漆酶已经有大量的研究报道，不同来源的漆酶性质和功能也有所不同，酸碱耐受性、温度稳定性等区别很大，在生产应用中的潜力也有所限制和不同。来源不同的漆酶染料降解能力和偏好性也大不相同，在添加中间介质后，漆酶催化底物范围扩大，催化效果增强。重组表达Kurthia属菌株漆酶LaclK属碱性酶，在中性偏碱环境、添加ABTS等介质条件下能够降解90%以上的对维多利亚蓝和乙基紫，但对孔雀绿的降解率不高（郭翔，2016）。芽孢杆菌B.subtilis168CotA漆酶，没有中间介质参与，对结晶紫、溴酚蓝、孔雀绿和刚果红的降解绿分别为95%、81%、62%和59%，但对甲基红和亮黄降解率较低，仅为32%和19%（Samaketal.,2017）。因此需要不断发掘新型来源、具有广谱耐受性和酶活更稳定的漆酶。藻类漆酶是一种新型来源的漆酶，目前报道较少。现有技术中，关于集胞藻漆酶slr1573基因的酶学性质及其应用尚未有相关报道。
技术实现思路
针对现有技术中藻类漆酶来源较少等问题，本专利技术提供了一种源于集胞藻漆酶基因。本专利技术还提供了一种源于集胞藻漆酶基因在染料脱色中的应用。本专利技术为了实现上述目的所采用的技术方案为：本专利技术提供了一种源于集胞藻漆酶基因，该漆酶基因的DNA序列如SEQIDNO.1所示，编码蛋白质氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。本专利技术提供的漆酶基因的克隆方法为：提取集胞藻Synechocystis6803基因组DAN作为模板，设计引物slr1573-NheI-F/slr1573-XhoI-R，以集胞藻6803基因组为模板扩增得到slr1573漆酶基因开放阅读框795bp，扩增引物slr1573-NheI-F序列如SEQIDNO.3所示，slr1573-XhoI-R序列如SEQIDNO.4所示。本专利技术还提供了一种集胞藻漆酶基因的重组漆酶原核表达载体的构建方法，包括以下步骤：(1)提取集胞藻Synechocystis6803基因组DAN；（2）以集胞藻6803基因组DNA为模板，slr1573-NheI-F/slr1573-XhoI-R为上、下游引物，扩增slr1573基因；（3）回收纯化目标PCR产物。（4）将回收纯化的slr1573PCR产物与原核表达载体pET-28a（+）连接得到重组载体pET-28a（+）-slr1573。本专利技术还提供了一种源于集胞藻漆酶基因的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)提取集胞藻Synechocystis6803基因组DAN；（2）以集胞藻6803基因组DNA为模板，slr1573-NheI-F/slr1573-XhoI-R为上、下游引物，扩增slr1573基因；（3）回收纯化目标PCR产物。（4）将回收纯化的slr1573PCR产物与原核表达载体pET-28a（+）连接得到重组载体pET-28a（+）-slr1573；（5）将构建好的pET-28a（+）-slr1573转化大肠杆菌BL2(DE3)，得到能够大量表达Slr1573重组漆酶的BL21(DE3)/pET-28a（+）-slr1573菌株，发酵后得重组漆酶。本专利技术的再一目的为提供了一种上述源于集胞藻漆酶基因在染料脱色中的应用。进一步的，所述染料为孔雀绿、活性蓝、溴酚蓝、品红、结晶紫、甲基橙。最优化的染料为孔雀绿。本专利技术获得的漆酶酶学性质的测定，步骤如下：（1）pH对重组酶酶活及稳定性影响；（2）温度对重组酶酶活及稳定性影响；（3）金属离子及抑制剂对重组酶酶活的影响；（4）卤离子对重组酶酶活的影响。本专利技术针对集胞藻6803中新型漆酶Slr1573进行研究，通过大肠杆菌原核表达，对其酶学性质进行研究，明确了该酶的最适温度、pH、温度稳定性、pH稳定性、离子稳定性等酶学特性。我们用粗酶液对染料进行降解实验，获得了Slr1573染料对孔雀蓝的降解功能，为集胞藻6803漆酶Slr1573的应用提供基础。本专利技术的有益效果为：本专利技术构建了集胞藻漆酶基因slr1573的原核表达载体，并转化大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)，成功获得表达重组Slr1573的菌株，对重组漆酶粗酶液酶学性质进行了检测，本专利技术获得的slr1573漆酶基因获得高效表达，重组漆酶可高效催化孔雀绿等染料脱色。附图说明图1PCR扩增slr1573基因全长;图2重组质粒验证电泳图；其中，M为Trans2KPlusDNAMarker，1泳道为pET-28a（+）-slr1573质粒，2泳道为pET-28a（+）-slr1573质粒经NheI和XhoI限制性内切酶双酶切产物。图3pET-28a（+）-slr1573转大肠杆菌BL21(DE3)菌液PCR鉴定；其中，M是Trans2KDNAMarker;1-7是pET-28a（+）-slr1573菌液PCR条带。图4最佳诱导剂浓度筛选；其中，M是蛋白预染marker；空载为BL21/PET28a（+）诱导表达产物；0h、2h、4h和6h为BL21/pET28a（+）-slr1573不同浓度IPTG诱导表达产物；上清和沉淀为BL21/pET28a（+）-slr1573不同浓度IPTG诱导表达6h产物超声破碎的上清和沉淀样品。图5Slr1573融合蛋白不同诱导温度表达；其中，M是蛋白预染marker；空载为BL21/PET28a（+）诱导表达产物；0h、2h、4h和6h为BL21/PET28a（+）-slr1573不同浓度IPTG诱导表达产物；上清和沉淀为BL21/PET28a（+）-slr1573不同浓度IPTG诱导表达6h产物超声破碎的上清和沉淀样品。图6Slr1573融合蛋白Westernblot检测；其中，1-2都为BL21/PET28a（+）-slr1573表达融合蛋白。图7不同pH对Slr1573漆酶催化活力的影响；图8以ABTS为底物，不同pH对于Slr1573漆酶稳定性影响；图9不同温度对Slr1573漆酶催化活力的影响；图10以ABTS为底物，Slr1573漆酶温度稳定性；图11卤素对Slr1573漆酶酶活的影响；具体实施方式下面结合实施例对本专利技术的技术方案做进一步说明，但本专利技术所保护范围不限于此。生物材料来源集胞藻（Synechocystissp.）PCC6803基因组DNA为本实验室提取保藏；大肠杆菌DH5α和BL21(DE3)感受态购自北京全式金生物技术有限公司；DNA凝胶回收试剂盒、质粒回收试剂盒购自O本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种源于集胞藻漆酶基因，其特征在于，该漆酶基因的DNA序列如SEQ ID NO.1所示，编码蛋白质氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

【技术特征摘要】
1.一种源于集胞藻漆酶基因，其特征在于，该漆酶基因的DNA序列如SEQIDNO.1所示，编码蛋白质氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。2.根据权利要求1所述的集胞藻漆酶基因，其特征在于，该漆酶基因的克隆方法为：提取集胞藻Synechocystis6803基因组DAN作为模板，设计引物slr1573-NheI-F/slr1573-XhoI-R，以集胞藻6803基因组为模板扩增得到slr1573漆酶基因开放阅读框789bp，扩增引物slr1573-NheI-F序列如SEQIDNO.3所示，slr1573-XhoI-R序列如SEQIDNO.4所示。3.一种如权利要求1或2所述的集胞藻漆酶基因的重组漆酶原核表达载体的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)提取集胞藻Synechocystis6803基因组DAN；（2）以集胞藻6803基因组DNA为模板，slr1573-NheI-F/slr1573-XhoI-R为上、下游引物，扩增slr1573基因；（3）回收纯化目标PCR产物。（4）将回收纯化的slr1573PCR产物与原核表达载体p...

【专利技术属性】
技术研发人员：张燕，岳寿松，张伟，陈高，于金慧，杨建，罗时华，王俊艳，边斐，游银伟，钟怀荣，朱友峰，
申请(专利权)人：山东省农业科学院生物技术研究中心，
类型：发明
国别省市：山东,37