一种索玛鲁肽的制备方法技术

本发明专利技术属于多肽合成领域，特别涉及一种新的索玛鲁肽的制备方法，既能减少杂质的产生，尤其是[D‑His

A Method for the Preparation of Somalou Peptide

【技术实现步骤摘要】
一种索玛鲁肽的制备方法
本专利技术属于多肽合成领域，特别涉及一种新的索玛鲁肽的制备方法，既能减少杂质的产生，尤其是[D-His1]-索玛鲁肽，又可提高产率，降低生产成本，可用于工业上大规模生产索玛鲁肽。技术背景索玛鲁肽(Sermaglutide)是诺和诺德公司开发的新一代GLP-1类似物，该产品能显著降低2型糖尿病患者的糖化血红蛋白(HbA1c)水平及减轻体重，同时大大降低低血糖的风险。从结构上看，索玛鲁肽是将GLP-1(7-37)链上8位的Aib取代了Ala，34位的Arg取代了Lys，26位的Lys接上十八烷酸脂肪链。与利拉鲁肽相比，索玛鲁肽分子中20位赖氨酸侧链氨基上所引入的修饰基团比利拉鲁肽更大，对多肽药物分子抵御体内代谢的能力更强，在体内的药物作用时间更长。索玛鲁肽分子中短链的PEG修饰使得药物分子的亲水性大大增强。PEG修饰后不但可以与白蛋白紧密结合，掩盖DPP-4酶水解位点，还能降低肾排泄，可延长生物半衰期，达到长循环的效果。索玛鲁肽已于2016年12月正式向FDA提交了上市申请，并于在2017年12月7日获得FDA批准。该产品的上市将为改善2型糖尿病患者治疗提供独本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种索玛鲁肽的制备方法，其包括步骤如下：(1)以Fmoc‑Gly‑Wang树脂或Fmoc‑Gly‑2‑Chlorotrityl树脂为原料，加入脱保护剂，脱除所述树脂上的Fmoc保护基；(2)将步骤(1)脱除Fmoc保护基的树脂在活化助剂和缩合剂存在下采用逐一偶联的方式依次连接Fmoc保护的氨基酸，每一个偶联反应均以茚三酮检测阴性为反应终点，反应完毕用脱保护剂脱除Fmoc保护基，再与下一个Fmoc保护的氨基酸进行偶联反应；重复操作直至合成得到侧链全保护索玛鲁肽[21‑31]片段肽‑树脂：Fmoc‑Glu(OtBu)‑Phe‑Ile‑Ala‑Trp(Boc)‑Leu‑Val‑Arg(Pbf)‑...

【技术特征摘要】
1.一种索玛鲁肽的制备方法，其包括步骤如下：(1)以Fmoc-Gly-Wang树脂或Fmoc-Gly-2-Chlorotrityl树脂为原料，加入脱保护剂，脱除所述树脂上的Fmoc保护基；(2)将步骤(1)脱除Fmoc保护基的树脂在活化助剂和缩合剂存在下采用逐一偶联的方式依次连接Fmoc保护的氨基酸，每一个偶联反应均以茚三酮检测阴性为反应终点，反应完毕用脱保护剂脱除Fmoc保护基，再与下一个Fmoc保护的氨基酸进行偶联反应；重复操作直至合成得到侧链全保护索玛鲁肽[21-31]片段肽-树脂：Fmoc-Glu(OtBu)-Phe-Ile-Ala-Trp(Boc)-Leu-Val-Arg(Pbf)-Gly-Arg(Pbf)-Gly-树脂(3)将步骤(2)制备的侧链全保护的索玛鲁肽[21-31]片段肽-树脂用脱保护剂脱除Fmoc保护后，再与Fmoc-Lys(P)-OH在活化助剂和缩合剂存在下进行固相偶联反应，得到侧链全保护索玛鲁肽[20-31]片段肽-树脂：Fmoc-Lys(P)-Glu(OtBu)-Phe-Ile-Ala-Trp(Boc)-Leu-Val-Arg(Pbf)-Gly-Arg(Pbf)-Gly-树脂其中，P选自-AEEA-Alloc或-AEEA-AEEA-Alloc；当P为-AEEA-Alloc时，Fmoc-Lys(P)-OH对应的结构如式I所示；当P为-AEEA-AEEA-Alloc时，Fmoc-Lys(P)-OH对应的结构如式II所示；(4)将步骤(3)制备的侧链全保护的索玛鲁肽[20-31]片段肽-树脂用脱保护剂脱除Fmoc保护后，按照步骤(2)相同的偶联方法，再依次与剩余的氨基酸在活化剂和缩合剂的存在下顺序进行偶联反应，得到侧链全保护的索玛鲁肽-树脂前体，结构如下：R1-His(R2)-Aib-Glu(OtBu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Val-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-Leu-Glu(OtBu)-Gly-Gln(Trt)-Ala-Ala-Lys(P)-Glu(OtBu)-Phe-Ile-Ala-Trp(Boc)-Leu-Val-Arg(pbf)-Gly-Arg(pbf)-Gly-树脂(5)当P为-AEEA-AEEA-Alloc时，将步骤(4)制备的侧链全保护的索玛鲁肽-树脂前体用脱保护试剂脱除烯丙氧羰基(Alloc)后，再与十八烷二酸单叔丁酯-Glu-OtBu在活化助剂和缩合剂存在下进行固相偶联反应，得到侧链全保护索玛鲁肽-树脂；或者当P为-AEEA-Alloc时，将步骤(4)制备的侧链全保护的索玛鲁肽-树脂前体用脱保护试剂脱除烯丙氧羰基(Alloc)后，先偶联Alloc-AEEA-OH，然后脱出保护基Alloc后，再与十八烷二酸单叔丁酯-Glu-OtBu在活化助剂和缩合剂存在下进行固相偶联反应，得到侧链全保护索玛鲁肽-树脂；其中十八烷二酸单叔丁酯-Glu-OtBu的结构为：(6)经裂解剂裂解除去侧链全保护索玛鲁肽-树脂上的树脂和保护基团，经沉淀，得到索玛鲁肽粗品；进一步地，还包括：(7)索玛鲁肽粗品的纯化：将上述步骤(6)得到的索玛鲁肽粗品经反相高效液相色谱纯化，冻干得到索玛鲁肽纯品；其中，其中，R1独立地选自Boc、Cbz、Fmoc、ivDde、Dde；R2独立地选自Boc、Fmoc、Cbz、ivDde、Dde、Trt、Mmt、Mtt；所述脱保护剂为哌啶与N，N-二甲基甲酰胺的体积比为1：4的混合溶液；所述的裂解剂为三氟乙酸、三异丙基硅烷、苯甲硫醚、乙二硫醇和水组成的混合物，三氟乙酸：三异丙基硅烷：苯甲硫醚：乙二硫醇：水＝90～95:0～5:0～5:0～5:0～5体积比；所述活化助剂选自1-羟基苯并三氮唑(HOBt)、N-羟基-7-氮杂苯并三氮唑(HOAt)；优选为1-羟基苯并三氮唑(HOBt)中的一种或多种；所述的缩合剂选自N，N-二异丙基碳二亚胺(DIC)、N，N-二环己基碳二亚胺(DCC)、(1-氰基-2-乙氧基-2-氧代亚乙基氨基氧基)二甲基氨基-吗啉-碳鎓六氟磷酸盐(COMU)、六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷(PyBOP)、2-(7-氮杂-1H-苯并三氮唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲六氟磷酸酯(HATU)、苯并三氮唑-N，N，N’，N’-四甲基脲六氟磷酸盐(HBTU)或O-苯并三氮唑-N，N，N’，N-四甲基脲四氟硼酸酯(TBTU)中的一种或多种；优选为N，N-二异丙基碳二亚胺(DIC)、苯并三氮唑-N,N,N’,N’-四甲基脲六氟磷酸盐(HBTU)、2-(7-氮杂-1H-苯并三氮唑-1-基)-1,1，3，3-四甲基脲六氟磷酸酯(HATU)中的一种或多种。2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述的Fmoc-Gly-Wang树脂或Fmoc-Gly-2-chlorotrityl树脂的荷载量为0.1～0.6mmol/g，优选0.2～0.5mmol/g；树脂与脱保护剂投料比为1:10～50，优选1:20～40，单位：mol/L；脱保护反应时间为每次10min；优选重复脱保护3次；步骤(2)中所述的Fmoc保护的氨基酸及其依次连接顺序为：Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Arg(pbf)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Arg(pbf)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH；步骤(2)缩合剂的用量与树脂中氨基的摩尔比为2～6:1，优选3～5：1；更优选4：1；步骤(2)活化助剂与树脂中氨基的摩尔比为2～6:1，优选3～5：1；更优选4：1；步骤(2)中所述的偶联反应时间为30～150min，优选60～120min；步骤(3)中所述的Fmoc-Lys(P)-OH的用量与侧链全保护的索玛鲁肽[21-31]片段肽-树脂的用量的摩尔比为2～5:1，优选3:1；步骤(4)氨基酸以下列形式应用并依次连接的保护氨基酸为：Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Aib-OH、R1-His(R2)-OH；步骤(5)中所述脱保护试剂为Pd(Ph3P)4做为催化剂，与还原剂配合使用，所述还原剂选自：PhSiH3、NaBH4、Bu3SnH、HCO2H、TEA、双甲酮中的一种或多种；步骤(5)中所述的十八烷二酸单叔丁酯-Glu-OtBu的用量与侧链全保护的索玛鲁肽[1-31]肽-树脂前体的用量的摩尔比为2～5:1；进一步优选3:1；步骤(6)所述的裂解剂的用量与侧链全保护索玛鲁肽-树脂之比为5～20：1，优选8～15ml/g，更优选10：1，单位：ml/g；步骤(6)所述的裂解反应时间为1～5h，优选为1.5～3.5h。3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(7)索玛鲁肽粗品的纯化方法具体保护以下步骤和条件：高效液相色谱柱参数为：色谱填料为10μm的反相C8固定相，色谱柱直径为50毫米、长度为250毫米，纯化方法步骤如下：称取索玛鲁肽粗品溶于适量水中，微孔滤膜过滤，将滤液用高效液相色谱柱纯化，流动相为体积比0.1％三氟乙酸水溶液—体积比0.1％三氟乙酸乙腈溶液，梯度洗脱，循环纯化，合并主峰溶液减压浓缩，蒸除乙腈，冷冻干燥得索玛鲁肽纯品。4.一种权利要求1所述Fmoc-Lys(AEEA-Alloc)-OH的制备方法，其包括以下步骤：将碳酸钾溶于水中，加入2-(2-(2-氨基乙氧基)乙氧基)乙酸和四氢呋喃，搅拌均匀，向上述溶液中滴加氯甲酸烯丙酯，室温下搅拌反应18小时；反应结束后将反应液进行减压浓缩，浓缩液用乙醚进行萃取3次，水相用浓盐酸调节至PH值2左右后用二氯甲烷萃取3次，合并有机相用饱和食盐水洗涤，再用无水硫酸镁干燥，过滤后减压浓缩滤液获得Alloc-AEEA-OH；将Alloc-AEEA-OH和N-羟基丁二酰亚胺溶于四氢呋喃中，加入二环己基碳二亚胺，室温搅拌反应18小时；反应结束后，过滤反应液，滤饼用四氢呋喃进行洗涤，合并滤液后进行减压浓缩，再重新溶于二氯甲烷，溶液在0℃静置30分钟后，过滤，固体用二氯甲烷洗涤，合并滤液后进行加压浓缩，获得Alloc-AEEA-OSu；将Fmoc-Lys-OH、碳酸钠溶于水中，加入Alloc-AEEA-OSu的1,4-二氧六环溶液，搅拌反应2～3h，TLC检测反应结束后，浓缩除去1，4-二氧六环，加入2mol/L盐酸调节溶液pH值至2-3，析出大量固体，抽滤收集固体产品，水洗，干燥后柱层析纯化得Fmoc-Lys(AEEA-Alloc)-OH；其中，Fmoc-Lys-OH与碳酸钠的摩尔比为1:2。5.一种权利要求1所述Fmoc-Lys(AEEA-AEEA-Alloc)-OH的制备方法，其包括以下步骤：将2-(2-(2-氨基乙氧基)乙氧基)乙酸、碳酸钠溶于适量水中，加入Alloc-AEEA-OSu的1,4-二氧六环溶液，搅拌反应2～3h，TLC检测反应结束后，浓缩除去1,4-二氧六环，加入2mol/L盐酸调节溶液pH值至2-3，析出大量固体，抽滤收集固体产品，水洗，干燥后得Alloc-AEEA-AEEA-OH；将Alloc-AEEA-AEEA-OH和N-羟基丁二酰亚胺溶于四氢呋喃中，加入二环己基碳二亚胺，室温搅拌反应18小时；反应结束后，过滤，滤饼用四氢呋喃进行洗涤，合并滤液后进行减压浓缩，再重新溶于二氯甲烷，溶液在0℃静置30分钟后，进行过滤，固体用二氯甲烷洗涤，合并滤液后进行加压浓缩，获得Alloc-AEEA-AEEA-OSu；将Fmoc-Lys-OH、碳酸钠溶于适量水中，加入Alloc-AEEA-AEEA-OSu的1,4-二氧六环溶液，搅拌反应2～3h，TLC检测反应结束后，浓缩除去1，4-二氧六环，加入2mol/L盐酸调节溶液pH值至2-3，析出大量固体，抽滤，收集固体产品，水洗，干燥后柱层析纯化得Fmoc-Lys(AEEA-AEEA-Alloc)-OH；其中，Fmoc-Lys-OH与碳酸钠的摩尔比为1:2。6.一...

【专利技术属性】
技术研发人员：田振平，石鑫磊，韩荣刚，薛琛琛，彭海涛，匡德琦，
申请(专利权)人：齐鲁制药有限公司，
类型：发明
国别省市：山东,37