【技术实现步骤摘要】
一种chIRF3的原核表达及多克隆抗体的制备方法
本专利技术涉及一种chIRF3的原核表达及多克隆抗体的制备方法，尤其涉及一种对chIRF3蛋白具有特异性多克隆抗体的制备方法。
技术介绍
干扰素调节因子(IRF)是一种由生物体的淋巴细胞或单核细胞在机体受到病毒或其他诱生剂的作用下产生的分泌性可溶糖蛋白。IRF生物学活性为造血发育，细胞生长，细胞凋亡和肿瘤发生等方面。IRF家族中鸡源IRF3(chIRF3)表现出对病毒感染有着独特反应，研究表明鸡源IRF3(chIRF3)对于干扰素基因IFN的表达调控比IRF1的作用还重要。chIRF3基因定位19q，编码427个氨基酸，蛋白的分子量55kDa，结构为螺旋-转角-螺旋。chIRF3从N端到C端的结构域为DNA结合结构域DBD，转录活化结构域TAD，反应结构域RD，在细胞静息状态下，chIRF3处于细胞质中不参与他蛋白物质结合并且表现为单体失活状态，原因是TAD两侧有两个自身抑制结构域AID起到掩盖TAD作用,防止chIRF3移至细胞核与核内的DNA结合。一旦受到病毒干扰入侵或dsRNA刺激，chIRF3活化是受C端上...
【技术保护点】
1.一种chIRF3的原核表达及多克隆抗体的制备方法，其特征在于，所述chIRF3的原核表达及多克隆抗体的制备方法包括如下步骤：步骤①：引物设计，引物序列如下：chIRF3‑F：5’‑GG
【技术特征摘要】
1.一种chIRF3的原核表达及多克隆抗体的制备方法，其特征在于，所述chIRF3的原核表达及多克隆抗体的制备方法包括如下步骤：步骤①：引物设计，引物序列如下：chIRF3-F：5’-GGGGTACC(KpnⅠ酶切位点)ATGGCAGCACTGGACAGCGAG-3’；chIRF3-R：5’-GGGAAGCTT(KindⅢ酶切位点)TCAGTCTGTCTGCATGTG-3’；步骤②：cDNA的扩增，将新鲜的鸡肝脏组织研磨成细胞，提取总RNA后使用RNA纯化试剂盒纯化，利用HiFiScriptcNDA第一链合成试剂盒逆转录成cDNA；步骤③：以逆转录产物cDNA作为模板，配置25μl的PCR扩增体系扩增；步骤④：使用DNA纯化试剂盒纯化的PCR产物和大肠杆菌PET-32a分别经过KpnⅠ酶与KindⅢ酶进行双酶切，1％琼脂糖凝胶电泳检测后切胶回收，配置10μl的连接体系；步骤⑤：chIRF3-PET重组质粒的收集，取10μl的连接产物加入100μl的大肠杆菌DH5α，混合后置于冰上20min，45℃热击90s，迅速放回冰上静置5min，接种于含Amp的固体培养基中倒置培养，挑取单菌落于含Amp的培养基中过夜培养，离心收集菌体提取chIRF3-PET重组质粒，通过酶切和PCR鉴定质粒证实构建成功；步骤⑥：chIRF3蛋白制备，将3μl的chIRF3-PET重组质粒加入50μl的感受态表达菌株BL21冰上30min，45℃热击90s，迅速放回冰上5min，含Amp的LB固体培养基中37℃倒置过夜培养，挑取白色单菌落于含Amp的LB培养基中过夜培养，加入IPTG诱导表达，诱导参数的温度、时间和转数的设置；步骤⑦：抗chIRF3蛋白多克隆抗体的制备，利用His标签蛋白纯化试剂盒进行chIRF3的蛋白纯化，纯化后的chIRF3蛋白作为抗原制备chIRF3多克隆抗体，在13周龄雄性新西兰大白兔背部皮下多点进行4次免疫后，颈动脉取血分离血清并纯化得到抗chIRF3蛋白多克隆抗体，冻干后置于-80℃保存。2.如权利要求1所述的一种chIRF3的原核表达及多克隆...
【专利技术属性】
技术研发人员：何秀苗，李尚泉，陈艳艳，陈博文，刘玉晶，黄海佩，
申请(专利权)人：广西民族大学，
类型：发明
国别省市：广西,45
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