一种去膜端黄卵的整胚固定方法技术

本发明专利技术提供一种去膜端黄卵的整胚固定方法，是将端黄卵置于三氯乙酸水溶液中进行室温固定；去掉三氯乙酸水溶液，将端黄卵再用多聚甲醛溶液进行固定；用磷酸缓冲溶液(PBS)置换部分多聚甲醛固定液，4℃保存待用；再极爱你个固定后的受精卵的受精膜去掉，得到完整的胚胎，用磷酸缓冲液或甲醇保存，用于后续的整胚免疫组化或细胞学相关研究。本发明专利技术的固定方法固定后的端黄卵，胚胎有韧性，去膜时不易破碎，容易得到完整的胚胎。

A Whole Embryo Fixation Method for Demembranous Yolk Eggs

【技术实现步骤摘要】
一种去膜端黄卵的整胚固定方法
本专利技术属于胚胎固定研究
，具体涉及一种去膜端黄卵的整胚固定方法。
技术介绍
免疫组化技术或免疫细胞化学技术是利用抗原-抗体特异性反应来研究特定蛋白质在组织细胞中的定性、定位及相对定量表达的有效方法。样品固定是免疫组化分析首要的关键环节。从免疫组化技术的角度，固定的作用是使细胞内蛋白质凝固，尽量减少或终止外源性酶和内源性酶的反应；防止细胞的自溶，以免使抗原扩散至组织间质；保持组织的固有形态和结构；更重要的是保持组织或细胞的抗原性，使抗原不致失活，也不发生弥散现象，减少免疫组化染色的背景色。样品固定的主要目的是保存细胞固有的物质，凝固或沉淀细胞内或组织液中的固有物质，如细胞核、内质网、线粒体、高尔基器、溶酶体、过氧体，细胞骨架，组织液，抗原等，使细胞或组织基本上保持生活时的物质状态。但端黄卵呈极性分布，卵黄含量很高，集中于植物极；其中原生质较少，且主要集中于动物极。对端黄卵进行免疫组化分析，如采用常规的固定方法如4％多聚甲醛固定方法，虽然对于胚盘部分固定效果较好，可以将固定后胚盘完整的剥离出来，进行免疫组化分析，但4％多聚甲醛不能使液态的卵黄物质凝固，固定后得不到完整的胚胎，不便于进行整胚免疫组化分析。丙酮和甲醇对液态卵黄有固化作用，对于去掉受精膜后的受精卵固化效果较好，可以得到完整的胚胎。但对于未去受精膜的受精卵固化效果较差，如果采用丙酮和甲醇固定后再去膜，就得不到完整的胚胎。为便于大分子蛋白抗体进入卵细胞内部与待测蛋白(抗原)结合，免疫组化技术在卵细胞方面的应用，均需将受精膜去掉。为了使细胞或组织基本上保持生活时的物质状态，均需即时固定。因此，将活卵的受精膜去掉后再固定，是不容易做到的，尤其对于受精膜与卵黄膜之间的卵周隙窄小的端黄卵，必须固定后再去受精膜。鉴于常规固定方法固定端黄卵无法得到去膜的完整胚胎，需要建立一种去膜端黄卵的整胚固定方法，便于进行整胚免疫组化或细胞学相关研究。
技术实现思路
针对常规固定方法用于端黄卵固定中存在的不足，本专利技术提供一种去膜端黄卵的整胚固定方法，能够解决端黄卵的整胚免疫组化或细胞学相关研究需要。本专利技术所提供的去膜端黄卵的整胚固定方法，包括以下步骤：1)三氯乙酸固定：将端黄卵置于三氯乙酸水溶液中进行室温固定；所述的三氯乙酸水溶液的浓度为4-6％；室温固定时间为固定0.5-2h；2)多聚甲醛固定：去掉三氯乙酸水溶液，将端黄卵再用多聚甲醛溶液进行固定；所述的多聚甲醛溶液的浓度为4％；3)置换固定液：用磷酸缓冲溶液(PBS)置换部分多聚甲醛固定液，4℃保存待用；所述的磷酸缓冲溶液(PBS)的组分：128mMNaCl,2mMKCl,8mMNaH2PO4,2mMKH2PO4,pH7.2。4)去膜：将3)中固定后的受精卵的受精膜去掉，得到完整的胚胎，用磷酸缓冲液或甲醇保存，用于后续的整胚免疫组化或细胞学相关研究。进一步的，上述固定方法，具体包括以下步骤：1)三氯乙酸固定：将端黄卵吸入离心管中，去掉溶液后加入4-6％的三氯乙酸溶液，室温固定0.5-2小时；作为优选，是使用6％浓度的三氯乙酸固定0.5小时，或4％浓度的三氯乙酸固定1小时；2)多聚甲醛固定：去除三氯乙酸溶液，在端黄卵中加入4％多聚甲醛溶液，4℃固定过夜或室温固定2-3小时；3)置换固定液：多聚甲醛固定完后，用磷酸缓冲溶液(PBS)置换相应3/4-4/5体积的多聚甲醛溶液，并于4℃保存待用；4)去膜：将步骤3)处理后的受精卵的受精膜去掉，得到固定的完整的胚胎。与常用的4％多聚甲醛固定受精卵的方法相比，本专利技术的优点如下：1.本专利技术的固定方法可以使端黄卵中的卵黄物质凝固，去膜后可以得到完整的胚胎，尤其适用于受精前期卵黄含量较高的端黄卵。2.本专利技术的固定方法固定后的端黄卵，受精膜与卵黄膜之间的卵周隙增大，便于手工去掉受精膜，尤其适用于卵周隙较少的端黄卵。3.本专利技术的固定方法固定后的端黄卵，胚胎有韧性，去膜时不易破碎，容易得到完整的胚胎。4.该方法的应用范围广泛，采用该方法对胚盘形成之前到2-细胞、4-细胞、8-细胞等卵黄含量较高的端黄卵进行固定，去膜后可以得到完整的胚胎，便于进行整胚免疫组化或细胞学相关研究。附图说明图1：4％三氯乙酸固定2小时，4％多聚甲醛4℃固定过夜的图，其中a为固定后胚胎，b为去膜后的胚胎；图2：6％三氯乙酸固定0.5小时，4％多聚甲醛4℃固定过夜图，其中a为固定后胚胎，b为去膜后的胚胎；图3：6％三氯乙酸固定1小时，4％多聚甲醛4℃固定过夜。a为固定后胚胎，b为去膜后的胚胎。具体实施方式本专利技术的固定方法，具体包括以下步骤：1)三氯乙酸固定：将端黄卵吸入离心管中，去掉溶液后加入4-6％的三氯乙酸溶液，室温固定0.5-2小时。固定时间的长短与三氯乙酸的使用浓度有关，使用的浓度越高，蛋白质浓缩作用越强，卵周隙增大越明显，固定时间可适当缩短；反之，使用的浓度越低，蛋白质浓缩作用越弱，卵周隙增大越不明显，固定时间可适当延长。依据卵周隙大小，6％浓度的三氯乙酸最短固定时间为0.5小时，4％浓度的三氯乙酸最短固定时间为1小时。2)多聚甲醛固定：倒掉三氯乙酸溶液，加入4％多聚甲醛溶液，4℃固定过夜。3)置换固定液：多聚甲醛固定完后，用磷酸缓冲溶液(PBS组分：128mMNaCl,2mMKCl,8mMNaH2PO4,2mMKH2PO4,pH7.2)置换相应3/4-4/5体积的多聚甲醛固定液，并于4℃保存待用；用磷酸缓冲液置换固定液时不需要反复冲洗，这样既有利于样品的长期保存，又不会影响染色效果。4)去膜：固定后受精卵的受精膜和卵黄膜之间出现明显的卵周隙，在解剖镜下，用尖头镊子或解剖针将受精膜去掉，得到完整的胚胎，用磷酸缓冲液(PBS)于4℃保存，或100％甲醇于-20℃冷冻保存，用于后续的整胚免疫组化或细胞学相关研究。下面结合附图和实施例详述本专利技术。实施例1大菱鲆受精后20min的受精卵，先用4％三氯乙酸固定2小时，再用4％多聚甲醛4℃固定过夜。具体过程如下：(1)三氯乙酸固定：用塑料吸管将端黄卵吸入离心管中，去掉溶液后加入4％的三氯乙酸溶液，室温固定2小时。(2)多聚甲醛固定：倒掉三氯乙酸溶液，加入4％多聚甲醛溶液，4℃固定过夜。(3)置换固定液：多聚甲醛固定完后，用磷酸缓冲溶液(PBS组分：128mMNaCl,2mMKCl,8mMNaH2PO4,2mMKH2PO4,pH7.2)置换相应3/4-4/5体积的多聚甲醛固定液，并于4℃保存待用。(4)去膜：固定后胚胎出现明显的卵周隙(如图1a)，将去膜后的胚胎于磷酸缓冲液4℃保存待用(如图1b)。由图1a和1b可见：固定后的胚胎皱缩较少，去膜后胚胎完整。实施例2大菱鲆受精后20min的受精卵，先用6％三氯乙酸固定0.5小时，再用4％多聚甲醛4℃固定过夜。具体过程如下：(1)三氯乙酸固定：用塑料吸管将端黄卵吸入离心管中，去掉溶液后加入6％的三氯乙酸溶液，室温固定0.5小时。(2)多聚甲醛固定：倒掉三氯乙酸溶液，加入4％多聚甲醛溶液，4℃固定过夜。(3)置换固定液：多聚甲醛固定完后，用磷酸缓冲溶液(PBS)置换相应3/4-4/5体积的多聚甲醛固定液，并于4℃保存待用。(4)去膜：固定后胚胎的卵周隙明显可见(如图2a)，将去膜后的胚胎于磷本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种去膜端黄卵的整胚固定方法，其特征在于，所述的方法包括如下的步骤：1)三氯乙酸固定：将端黄卵置于三氯乙酸水溶液中进行室温固定；2)多聚甲醛固定：去掉三氯乙酸水溶液，将端黄卵再用多聚甲醛溶液进行固定；3)置换固定液：用磷酸缓冲溶液PBS置换部分多聚甲醛固定液，4℃保存待用；4)去膜：将3)中固定后的受精卵的受精膜去掉，得到完整的胚胎，用磷酸缓冲液或甲醇保存。

【技术特征摘要】
1.一种去膜端黄卵的整胚固定方法，其特征在于，所述的方法包括如下的步骤：1)三氯乙酸固定：将端黄卵置于三氯乙酸水溶液中进行室温固定；2)多聚甲醛固定：去掉三氯乙酸水溶液，将端黄卵再用多聚甲醛溶液进行固定；3)置换固定液：用磷酸缓冲溶液PBS置换部分多聚甲醛固定液，4℃保存待用；4)去膜：将3)中固定后的受精卵的受精膜去掉，得到完整的胚胎，用磷酸缓冲液或甲醇保存。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的1)中所述的三氯乙酸水溶液的浓度为4-6％。3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的1)中室温固定时间为0.5-2h。4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的2)中多聚甲醛溶液的浓度为4％。5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的3)中所述的磷酸缓冲溶...

【专利技术属性】
技术研发人员：朱香萍，
申请(专利权)人：青岛农业大学，
类型：发明
国别省市：山东,37