一种从核桃无融合生殖胚诱导体细胞胚的方法技术

本发明专利技术公开了一种从核桃无融合生殖胚诱导体细胞胚的方法，包括以下步骤：(1)获得核桃无融合生殖的幼果，并对幼果进行消毒处理；(2)从消毒处理后的幼果中剥取幼胚，分离幼胚的胚轴和子叶作为外植体；(3)将外植体接种到初代培养基中进行培养，获得初生体细胞胚；(4)将初生体细胞胚接入增殖培养基，进行继代培养，获得次生体细胞胚。本发明专利技术有效解决了核桃体细胞胚诱导发生极为困难，体细胞胚继代增殖率低的问题。

A Method of Inducing Somatic Embryos from Apomixis Embryos of Walnut

【技术实现步骤摘要】
一种从核桃无融合生殖胚诱导体细胞胚的方法
本专利技术涉及植物组织培养
，具体涉及一种从核桃无融合生殖胚诱导体细胞胚的方法。
技术介绍
核桃(JuglansregiaL.)是人类最古老的食物之一，历史文献可以追溯到公元前7000年的波斯(Salas-Salvadóetal.，2011)。核桃栽培遍及世界六大洲的50个国家和地区，其中以亚洲、欧洲和美洲的核桃栽培面积最大，产量最高，其年产量约占世界总产量的98.76％(BernardAetal.，2018；FAOSTAT，2017)。我国是世界核桃生产大国，2015年我国核桃产量33.32万t，为2014年产量27.14万t的122.8％，核桃产业发展迅速(张淑英，2016)。核桃仁具有重要的营养和医疗保健价值，据《本草纲目》记载，“核桃仁，通命门，利三焦，益气养血，令人肥健、能食、润肌、黑发、固精、治燥、调血之功。”2004年美国食品与药物监理局(FDA)通过了对核桃作为健康食品的准可，核桃对于心血管疾病、Ⅱ型糖尿病、癌症和神经系统疾病有一定的康复治疗和预防效果，被称为“2l世纪的超级食品”(BitokEetal.，2017；MaYetal.，2010；李敏等，2009)。核桃木质重而坚硬，耐冲撞耐磨擦耐腐朽，容易乾燥，少变形，是优质高档用材(郗荣庭，1996)。历史上，由于核桃嫁接等无性繁殖难于成活，我国核桃一直采用实生繁殖，单株变异大，产量低、品质差，长期处于散生栽培状态(张美勇等，2000)。上个世纪90年代，利用夏季方块芽接技术提高了核桃嫁接成活率，解决了核桃嫁接繁殖瓶颈(李复温等，1996)，这极大推动了我国核桃良种化、商品化和产业化发展。核桃具有无融合生殖(Apomixis)现象(高绍棠等，1999)，无融合生殖是指植物不经过精卵细胞融合而产生有生活力种子的一种特殊生殖方式，其中双倍无孢子生殖和不定胚生殖能使世代重迭而不改变核相,可获得遗传结构上与母本完全相同的子代，通过无融合生殖植株中可以繁殖大量的具有优良基因型的优良品种，从而大大扩展了遗传资源的多样性(Richardetal，1994)。核桃的体细胞胚具有完整的两极结构，具有发育成完整植株的能力(Tuleckeetal，1999)，核桃体细胞胚能通过诱导增殖而形成体细胞胚无性系。将核桃无融合生殖的特性和体细胞胚诱导的技术结合不仅能加速核桃育种的速度，消除或减少通过繁殖传播的疾病，消除与有性生殖机制带来的作物损失，还能使优良核桃品种的产量大幅增加。目前已经有多种植物已经报道了体细胞胚的发生，对于大规模克隆，胚胎发生可能比器官发生更好，因为它可以直接产生完整的植物，此外，体细胞胚也是转基因的更好的材料(Gilletal.，2018)。关于核桃体细胞胚的诱导方法，自1985年Tulecke和McGranahan首次报道核桃的体细胞胚胎发生以来，国内外在这方面进行的研究较少，核桃体细胞胚是1985年Tulecke首次从自然授粉的核桃品种中诱导发生的，在这之后在核桃五个种三个杂种当中有了体细胞胚发生的报道(汤浩茹，2000)。袁巧平等(1990)通过在改良的DKW培养基上接种核桃幼胚经过20d左右的黑暗培养形成了球形、心形、鱼雷形等不同发育时期的体胚，但是其产生畸形胚的概率较高；1992年刘淑兰等将胚状体结构从叶柄中诱导出来，但未能形成体细胞胚；2011年张启香等以山核桃子叶为外植体于DKW、MS、1/2MS、WPM培养基上均诱导出了体细胞胚，但是体细胞胚诱导率较低。以上研究说明核桃体细胞能诱导发生，但没有稳定的核桃体细胞胚诱导发生体系，以致出胚较难。因此，建立高效稳定的核桃体细胞胚发生体系，提高核桃体细胞胚发生率，提高核桃次生胚增殖率，已成为目前国内外核桃组培中的难点。从上述有关核桃组织培养的研究结果看，国内外尚未见到详细的有关无融合生殖的核桃体细胞胚诱导发生的报道，尤其是缺少针对无融合生殖核桃取材时间、培养条件、培养基选择、增殖培养基选择的报道。
技术实现思路
针对上述现有技术，本专利技术的目的是提供一种从核桃无融合生殖胚诱导体细胞胚的方法，以解决核桃体细胞胚诱导发生极为困难，体细胞胚继代增殖率低的问题。为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：一种从核桃无融合生殖胚诱导体细胞胚的方法，包括以下步骤：(1)获得核桃无融合生殖的幼果，并对幼果进行消毒处理；(2)从消毒处理后的幼果中剥取幼胚，分离幼胚的胚轴和子叶作为外植体；(3)将外植体接种到初代培养基中进行培养，获得初生体细胞胚；(4)将初生体细胞胚接入增殖培养基，进行继代培养，获得次生体细胞胚。优选的，步骤(1)中，核桃无融合生殖的幼果的获得方法为：于3月份对优良核桃品种进行套袋处理，7～9周后摘袋收集核桃幼果。优选的，步骤(1)中，所述消毒处理方法为：将采集的核桃幼果剪去果柄、花柱及柱头，用洗涤剂清洗幼果，75％的酒精表面消毒30s，用水冲洗干净；3％的次氯酸钠溶液表面消毒25min，无菌水冲洗4～5次。优选的，步骤(2)中，从消毒处理后的幼果中剥取幼胚的方法为：于无菌条件下用灭菌的吸水滤纸吸干幼果表面水分，用无菌解刨刀切除青皮和果壳，取出完整幼胚。优选的，步骤(3)中，外植体的接种方法为：在每个含有初代培养基的培养皿中接种4～8个外植体，接种完后用封口膜封口。优选的，步骤(3)中，所述初代培养基为添加有0.5～2.0mg·L-16-BA、0.5～2.0mg·L-1KT、0.1～0.01mg·L-1IBA、20～30g·L-1蔗糖和7～8g·L-1琼脂的DKW培养基，pH值为5.6。优选的，步骤(3)中，所述培养的条件为：在黑暗条件下进行培养，培养温度为21～23℃，每天转移1次至新鲜的初代培养基中，1周后每周转移1次。优选的，步骤(4)中，将长度为2～4mm的初生体细胞胚接入增殖培养基。优选的，步骤(4)中，所述增殖培养基为添加有20～30g·L-1蔗糖和7～8g·L-1琼脂的DKW培养基，pH值为5.6。优选的，步骤(4)中，所述继代培养的条件为：在黑暗条件下进行培养，培养温度为21～23℃，接种后每两周转接1次培养基。本专利技术的有益效果：本专利技术所提供的从核桃无融合生殖胚诱导体细胞胚的方法解决了核桃体细胞胚诱导发生极为困难，体细胞胚继代增殖率低的问题，经实验统计：平均无融合生殖率为18.51％，无融合生殖体细胞胚诱导率可达14.36％以上，平均每个外植体产生3.6个初生体细胞胚，实现了核桃体细胞胚诱导的目的；本实验通过反复实验使次生胚体细胞胚产生率达到48.24％，实现了体细胞胚增殖的目的。应用本专利技术方法短时间内能提供大量的无融合生殖核桃的体细胞胚，为核桃离体培养提供大量的实验材料。附图说明图1：外植体选择。图2：外植体接种。图3：体细胞胚诱导。图4：体细胞胚增殖。图5：次生胚形态。具体实施方式应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属
的普通技术人员通常理解的相同含义。正如
技术介绍
部分所介绍的，目前没有稳定的核桃体细胞胚诱导发生体系，以致出胚较难。因此，建立高效稳定的核桃体细胞胚发生体系，提高核桃体细胞胚发生率，提高核桃次生胚增殖率，已成为目前本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种从核桃无融合生殖胚诱导体细胞胚的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)获得核桃无融合生殖的幼果，并对幼果进行消毒处理；(2)从消毒处理后的幼果中剥取幼胚，分离幼胚的胚轴和子叶作为外植体；(3)将外植体接种到初代培养基中进行培养，获得初生体细胞胚；(4)将初生体细胞胚接入增殖培养基，进行继代培养，获得次生体细胞胚。

【技术特征摘要】
1.一种从核桃无融合生殖胚诱导体细胞胚的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)获得核桃无融合生殖的幼果，并对幼果进行消毒处理；(2)从消毒处理后的幼果中剥取幼胚，分离幼胚的胚轴和子叶作为外植体；(3)将外植体接种到初代培养基中进行培养，获得初生体细胞胚；(4)将初生体细胞胚接入增殖培养基，进行继代培养，获得次生体细胞胚。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，核桃无融合生殖的幼果的获得方法为：于3月份对优良核桃品种进行套袋处理，7～9周后摘袋收集核桃幼果。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述消毒处理方法为：将采集的核桃幼果剪去果柄、花柱及柱头，用洗涤剂清洗幼果，75％的酒精表面消毒30s，用水冲洗干净；3％的次氯酸钠溶液表面消毒25min，无菌水冲洗4～5次。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，从消毒处理后的幼果中剥取幼胚的方法为：于无菌条件下用灭菌的吸水滤纸吸干幼果表面水分，用无菌解刨刀切除青皮和果壳，取出完整幼胚。5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨克强，段琪程，常董董，
申请(专利权)人：山东农业大学，
类型：发明
国别省市：山东,37