一种核桃体细胞胚生根和炼苗移栽的方法技术

本发明专利技术公开了一种核桃体细胞胚生根和炼苗移栽的方法，包括以下步骤：(1)体细胞胚的生长培养，(2)体细胞胚萌发，(3)体细胞胚生根，(4)体细胞胚苗移栽。本发明专利技术所提供的核桃体细胞胚生根和练苗移栽方法解决了核桃体细胞胚生根难，移栽成活率低的问题，经实验统计：体细胞胚的萌发率可达到45.22％，较之前有了很大提升，萌发的体细胞胚生根率可达到43.43％，使用生长发育良好的体细胞胚苗进行移栽成活率可达57.69％。应用本发明专利技术方法短时间内能提供大量的种苗，完全能够满足大规模生产的需要。

A method of somatic embryogenesis and seedling transplantation of walnut

【技术实现步骤摘要】
一种核桃体细胞胚生根和炼苗移栽的方法
本专利技术涉及植物组织培养
，具体涉及一种核桃体细胞胚生根和炼苗移栽的方法。
技术介绍
核桃属(Juglans)是胡桃科(Juglandaceae)落叶乔木，在全世界的范围内有20余种，地域分布广泛，在亚洲、美洲和欧洲均有分布(FordeandMcGranahan，1992)。核桃(JuglansregiaL.)是核桃属中经济价值最高的的一个种，在世界各地均有栽培(FordeandMcGranahan，1992)。核桃的原产地在中国，同时也是世界核桃的主产国，其栽培面积为世界第一，产量居世界第二(郗荣庭，1996)。核桃在我国具有悠久的栽培历史，不仅经济效益高营养丰富，也是医疗保健的重要材料(奚声珂，1996)。据《本草纲目》记载，核桃对润肺、补血、健胃、消痰有独特效果。被国内外医学家极度推崇，是养生保健延年益寿之精品(陈勤和李磊珂，2005)。核桃仁对大脑发育有特殊功效，亚油酸和亚麻酸在核桃仁中有较高含量，能够净化血液分解血液中的杂质，提高大脑的生理功能(孔凡真，2000)，也是人体理想的美容剂，核桃仁丙酮提物也具有抗衰老作用(毕敏和尹政，2006)。在最近的研究中核桃的青龙衣对肿瘤的预防和治疗有一定的功效，同时在传统中医学中青龙衣也是用来镇痛抑菌的中药材(仲军梅和刘玉梅，2014)。经济高速发展的今天，水污染和空气污染格外严重，用核桃壳制备活性炭能有效的对其进行防治(朱米家，2015)。核桃坚果内隔膜还是一味传统的中药材，具有固肾涩精的功效(张旭，2015)。核桃木木质重而坚硬，耐冲撞耐磨擦耐腐朽，容易乾燥，少变形；易施工，易於胶合。木质坚硬，适用于雕刻部份，能耐多变的气候，可施以任何涂装方法，最适於制造家具及室内装修。关于核桃体细胞胚的萌发与成苗，在核桃中，体细胞胚的发芽效率相对较低(Lee，1988；DengandCornu1992；Vahdatietal.，2006)。通常是因为体细胞胚想要萌发需要打破芽尖休眠作用，尽管有些体细胞胚没有经过冷藏处理也能萌发，但难以形成正常植株。Deng等(1998)采用脱水处理的方式可以提高体细胞胚萌发率3～5倍。增加ABA的浓度也能够提高体细胞胚发芽率，将ABA的浓度提高到5.0mg·L-1时体细胞胚发芽率可以提高6％(Kouroshetal.，2008)。Kourosh等(2008)通过对正常体细胞胚和异常的体细胞胚进行解刨发现蔗糖对体细胞胚萌发几乎没有影响。体细胞胚的健康程度也对体细胞胚发芽有重大影响，健康程度较差的体细胞胚，即使经过冷藏处理和脱水处理也难以萌发(Kouroshetal.，2008)。由于体细胞胚具有两极性，上下胚轴同时萌发，所以不需要单独对根进行诱导，只需选择合适的培养基进行生根培养，使其发育成完整的体胚苗(汤浩茹等，2000)。国内外研究表明虽然体胚能够萌发但增殖系数较低，远远满足不了大规模工厂化育苗和市场的大量需求，体胚苗生根难的问题未解决，在生产上根本无法应用。因此，建立高效稳定的核桃体细胞胚萌发、生根体系，解决核桃萌发生根困难的问题，已成为目前国内外核桃组培中的难点。关于核桃体细胞胚诱导和快繁国内外已经有了一定的报道(Tuleckeetal.，1985；Kornovaetal.，1989；袁巧平等，1990；汤浩茹等，2000；张启香等，2011)，但是关于核桃体细胞胚苗的炼苗、移栽驯化的研究较少，这对体细胞胚苗投入生产十分不利。
技术实现思路
针对上述现有技术，本专利技术的目的是提供一种核桃体细胞胚生根和炼苗移栽的方法，以解决核桃体细胞胚成苗困难的问题。为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：一种核桃体细胞胚生根和炼苗移栽的方法，包括以下步骤：(1)体细胞胚的生长培养：将核桃次生体细胞胚接种到基础培养基中，在20～24℃黑暗条件下进行培养，待体细胞胚发育至3～4mm时进行萌发处理；(2)体细胞胚萌发：将步骤(1)培养后的体细胞胚接种到萌发培养基上，培养2～3周后，再低温预处理2～3周，然后将低温预处理后的体细胞胚转接到新鲜的萌发培养基中，进行昼夜光照周期培养，6～9d后体细胞胚萌发；(3)体细胞胚生根：将萌发后具有上、下胚轴分化的体细胞胚接种到生根培养基中，在光照强度3000～3500lx、光照时间16h·d-1、24～26℃条件下培养12～15d，诱导生根；(4)体细胞培苗移栽：将步骤(3)中培养出的具有3～4片真叶、根系发育良好的体细胞胚苗进行炼苗处理，炼苗后再移栽到混合基质中进行培养。优选的，步骤(1)中，所述核桃次生体细胞胚是由核桃初生体细胞胚经增殖培养得到；增殖培养所采用的培养基为添加有1.0mg·L-16-BA、2.0mg·L-1KT、0.01mg·L-1IBA、30g·L-1蔗糖和7g·L-1琼脂的DKW培养基。所述核桃次生体细胞胚的长度为2mm。优选的，步骤(1)中，所述基础培养基为添加有20～30g·L-1蔗糖和7～8g·L-1琼脂的DKW培养基，pH值为5.6。优选的，步骤(1)中，培养过程中每隔1周转接1次新鲜的基础培养基。优选的，步骤(2)中，所述萌发培养基为添加有1.0～3.0mg·L-1GA3、20～30g·L-1蔗糖和7～8g·L-1琼脂的DKW培养基，pH值为5.6。优选的，步骤(2)中，所述昼夜光照周期培养的条件为：光照处理16h·d-1，光照强度为3000～3500lx，温度24～26℃。优选的，步骤(3)中，所述生根培养基为添加有1.0～3.0mg·L-16-BA、20～30g·L-1蔗糖和7～8g·L-1琼脂的DKW培养基，pH值为5.6。优选的，步骤(3)中，每个含有生根培养基的培养瓶中接种2～3个体细胞胚。优选的，步骤(4)中，所述炼苗处理具体为：将体细胞胚苗的培养瓶连同体细胞胚苗移出培养架，适应1d后逐渐打开培养瓶的封口膜；2～3d后取出体细胞胚苗，将体细胞胚苗上的培养基冲洗干净，移栽至由珍珠岩、草木灰和蛭石按体积比1：2：1组成的移栽基质中，移栽后用清水浇透，将体细胞胚苗放入遮阳网中遮阳，保持相对湿度在75％以上，炼苗1周。优选的，步骤(4)中，所述混合基质的成分以体积比计为：珍珠岩：草木灰：蛭石＝1：2：1。本专利技术的有益效果：本专利技术所提供的核桃体细胞胚生根和练苗移栽方法解决了核桃体细胞胚生根难，移栽成活率低的问题，经实验统计：体细胞胚的萌发率可达到45.22％，较之前有了很大提升，萌发的体细胞胚生根率可达到43.43％，使用生长发育良好的体细胞胚苗进行移栽成活率可达57.69％。应用本专利技术方法短时间内能提供大量的种苗，完全能够满足大规模生产的需要。附图说明图1：体细胞胚生长培养。图2：体细胞胚萌发。图3：体细胞胚生根培养。图4：在常温下炼苗。图5：温室炼苗。图6：温室炼苗(局部图)。具体实施方式应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属
的普通技术人员通常理解的相同含义。正如
技术介绍
部分介绍的，核桃体细胞胚存在生根难、移栽成活率低的问题，严重制约了核桃的大规模生产和种植。基于此，本专利技术的目的是提供于一种核桃体细胞胚生根和炼苗移栽的方法，以解决核本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种核桃体细胞胚生根和炼苗移栽的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)体细胞胚的生长培养：将核桃次生体细胞胚接种到基础培养基中，在20～24℃黑暗条件下进行培养，待体细胞胚发育至3～4mm时进行萌发处理；(2)体细胞胚萌发：将步骤(1)培养后的体细胞胚接种到萌发培养基上，培养2～3周后，再低温预处理2～3周，然后将低温预处理后的体细胞胚转接到新鲜的萌发培养基中，进行昼夜光照周期培养，6～9d后体细胞胚萌发；(3)体细胞胚生根：将萌发后具有上、下胚轴分化的体细胞胚接种到生根培养基中，在光照强度3000～3500lx、光照时间16h·d

【技术特征摘要】
1.一种核桃体细胞胚生根和炼苗移栽的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)体细胞胚的生长培养：将核桃次生体细胞胚接种到基础培养基中，在20～24℃黑暗条件下进行培养，待体细胞胚发育至3～4mm时进行萌发处理；(2)体细胞胚萌发：将步骤(1)培养后的体细胞胚接种到萌发培养基上，培养2～3周后，再低温预处理2～3周，然后将低温预处理后的体细胞胚转接到新鲜的萌发培养基中，进行昼夜光照周期培养，6～9d后体细胞胚萌发；(3)体细胞胚生根：将萌发后具有上、下胚轴分化的体细胞胚接种到生根培养基中，在光照强度3000～3500lx、光照时间16h·d-1、24～26℃条件下培养12～15d，诱导生根；(4)体细胞培苗移栽：将步骤(3)中培养出的具有3～4片真叶、根系发育良好的体细胞胚苗进行炼苗处理，炼苗后再移栽到混合基质中进行培养。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述核桃次生体细胞胚是由核桃初生体细胞胚经增殖培养得到；增殖培养所采用的培养基为添加有1.0mg·L-16-BA、2.0mg·L-1KT、0.01mg·L-1IBA、30g·L-1蔗糖和7g·L-1琼脂的DKW培养基。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述基础培养基为添加有20～30g·L-1蔗糖和7～8g·L-1琼脂的DKW培养基，pH值为5.6。4.根据权利要求1或3所述的方法，其特征...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨克强，段琪程，常董董，
申请(专利权)人：山东农业大学，
类型：发明
国别省市：山东,37