【技术实现步骤摘要】
ATP荧光lgCA-lgIA标曲法评价一次性卫生用品真菌杀灭效果的方法
本专利技术涉及一次性卫生用品的真菌杀灭效果评价方法，具体是一种应用ATP荧光光度计对以杀菌率R或灭菌指数A表征的一次性卫生用品真菌杀灭效果进行精准定量测试的ATP生物荧光lgCA-lgIA标准曲线法，属一次性卫生用品杀菌效果评价
技术介绍
近年来，伴随着城镇化进程的加速和消费者观念的改变,国内市场对一次性卫生用品的需求逐年递增；2017年市场销售总额已接近800亿元，年复合增长率为13.3％且出口大于进口；据权威机构预测，2023年全球一次性卫生用品市场规模将突破1611亿美元。作为与民生息息相关的细分行业,中国一次性卫生用品产业现已进入竞争激烈的转型期；受消费需求牵引，产品抗菌消毒功能成为企业技术创新的主攻方向之一。因此，相关质检技术和检测效率逐渐提上日程。近年来，伴随着城镇化进程的加速和消费者观念的改变,国内市场对一次性卫生用品的需求逐年递增；2017年市场销售总额已接近800亿元，年复合增长率为13.3％且出口大于进口；据权威机构预测，2023年全球一次性卫生用品市场规模将突破1611亿美元。作为与民生息息相关的细分行业,中国一次性卫生用品产业现已进入竞争激烈的转型期；受消费需求牵引，产品抗菌消毒功能成为企业技术创新的主攻方向之一。因此，相关质检技术和检测效率逐渐提上日程。目前，国内外抗菌消毒效果评价技术体系主要针对细菌和真菌，各国抗真菌效果测试方法原理多基于对白色念珠菌进行分离培养的平板计数法，鲜有涉及霉菌者；其中适用于白色念珠菌测试的一是日本工业标准提出的浸渍定量试...
【技术保护点】
1.一种一次性卫生用品真菌杀灭效果的评价方法，包括：(1)样品提取等要求；(2)设备选型及试剂、培养基配制；(3)菌种保藏、活化及菌悬液制备；(4)美蓝染色后菌悬液活菌含量CB的血球板计数；(5)ATP浓度对数值lgCA‑相对荧光强度对数值lgIA标准曲线建立及接种菌液的活菌ATP浓度CA标定；(6)中和剂鉴定及杀菌试验；(7)回收液相对荧光强度值IA测定；(8)回收液的活菌ATP浓度CA和TA推算以及杀菌率R和灭菌指数A计算；(9)结果评价；其特征在于，应用ATP荧光光度计对以杀菌率R或灭菌指数A表征的一次性卫生用品真菌杀灭效果进行精准定量评价的ATP生物荧光lgCA‑lgIA标准曲线法，具体的：在回收液相对荧光强度值IA测定中：明确对照样品和试验样品的提取、数量、尺寸等要求，将真菌试验菌种的标准菌株进行传代、活化后，取新鲜白色念珠菌或霉菌孢子培养物制备菌悬液；经美蓝染色后用血球计数板测定菌液中活菌含量CB，并对不同稀释度的菌悬液进行CB标定，然后，用ATP荧光试剂缓冲溶液将1.0×10
【技术特征摘要】
1.一种一次性卫生用品真菌杀灭效果的评价方法，包括：(1)样品提取等要求；(2)设备选型及试剂、培养基配制；(3)菌种保藏、活化及菌悬液制备；(4)美蓝染色后菌悬液活菌含量CB的血球板计数；(5)ATP浓度对数值lgCA-相对荧光强度对数值lgIA标准曲线建立及接种菌液的活菌ATP浓度CA标定；(6)中和剂鉴定及杀菌试验；(7)回收液相对荧光强度值IA测定；(8)回收液的活菌ATP浓度CA和TA推算以及杀菌率R和灭菌指数A计算；(9)结果评价；其特征在于，应用ATP荧光光度计对以杀菌率R或灭菌指数A表征的一次性卫生用品真菌杀灭效果进行精准定量评价的ATP生物荧光lgCA-lgIA标准曲线法，具体的：在回收液相对荧光强度值IA测定中：明确对照样品和试验样品的提取、数量、尺寸等要求，将真菌试验菌种的标准菌株进行传代、活化后，取新鲜白色念珠菌或霉菌孢子培养物制备菌悬液；经美蓝染色后用血球计数板测定菌液中活菌含量CB，并对不同稀释度的菌悬液进行CB标定，然后，用ATP荧光试剂缓冲溶液将1.0×10-3mol/L的ATP标准原液稀释为高、低浓度标准系列溶液：7.0×10-8mol/L、7.0×10-7mol/L、7.0×10-6mol/L和1.4×10-9mol/L、1.4×10-8mol/L、1.4×10-7mol/L，测定其相对荧光强度值IA；绘制两条相应浓度的lgCA-lgIA标准曲线，推导得出曲线方程式Y＝aA0X+bA0(高浓度)、Y＝aAX+bA(低浓度)和线性相关系数RA02(高浓度)、RA2(低浓度)，同时，用察氏培养液对活菌含量CB为5.0×108CFU/mL～9.0×108CFU/mL的试验菌种悬浮液进行连续10倍梯度稀释，测定稀释菌液的相对荧光强度值IA，根据高浓度标准曲线方程式Y＝aA0X+bA0推算其相应的活菌ATP浓度CA；经调整得到CA为5.0×10-7mol/L～9.0×10-7mol/L的接种菌液，在中和剂鉴定结果合格的条件下，向每件对照样品和试验样品的2块样片表面分别滴加0.1mL菌液并涂布均匀；待杀菌作用持续2、5、10、20min后，用4.7mL中和剂溶液对其进行洗脱回收，应用ATP荧光光度计测定回收液的相对荧光强度值和根据低浓度标准曲线方程式Y＝aAX+bA推算相应的活菌ATP浓度CAij和TAij；在杀菌率R或灭菌指数A计算中：根据ATP低浓度标准曲线lgCA-lgIA的线性方程式Y＝aAX+bA，以不同染/灭菌时间条件下每件对照样品和试验样品回收液的相对荧光强度测定值和作为基础数据；计算其在一个完整灭菌周期内的杀菌率Rij和灭菌指数Aij；对每组样品的Rij和Aij取算术平均值得到相应的Ri和Ai；每批一次性卫生样品的杀菌率R和灭菌指数A为其三组样品Ri、Ai的算术平均值；并明确相关数据修约和测量不确定度要求；在结果评价中：参考卫生行业通用做法和相关抗菌产品标准要求，确定真菌杀灭效果分级判定标准；当某组(件)一次性卫生样品的杀菌率Ri(Rij)或灭菌指数Ai(Aij)与其他两组(件)样品的真菌杀灭效果相比至少相差一个水平级时，重新提取一组(件)样品重复实验；计算其经ATP生物荧光lgCA─lgIA标准曲线法测得的杀菌率或灭菌指数，如果前后两组(件)一次性卫生样品的真菌杀灭效果水平相同，则弃之；取另外两组(件)剩余样品杀菌率Ri(Rij)或灭菌指数Ai(Aij)的算术平均值作为试验批次一次性卫生样品真菌杀灭效果的评价结果。2.根据权利要求1所述的一次性卫生用品真菌杀灭效果的评价方法，其特征在于，所述的样品提取等要求，按下述步骤进行：(1)对照样品：未添加任何抗菌成分且类别、材质、尺寸、数量等与待测一次性卫生样品相同，其中36件样品用于四段不同时间的杀菌效果试验，另外9件样品用于3次中和剂鉴定试验，实验前将各组对照样品置于超净工作台上紫外灭菌10min，然后分别放入45个无菌平皿中备用；(2)试验样品：使用一次后即丢弃、与人体直接或间接接触、用以满足人体生理卫生或卫生保健需求的各类日常生活用品，产品性状可为固体或液体；包括一次性使用手套或指套(不含医用手套或指套)、纸巾、湿巾、电话膜、帽子、口罩、内裤及妇女经期卫生用品(含卫生护垫)和尿布等排泄物卫生用品(不含厕纸)、避孕套等；从同一生产批号三个完整的运输包装中分别随机抽取16件最小销售包装样品，每个菌种使用3组杀菌试验样品,每组12件样品，分别等量取自三个不同的运输包装；单次中和剂鉴定试验需用4件取自同一运输包装的样品，3次中和试验所用样品分别取自不同的运输包装，待测样品外观整洁，符合该类卫生用品固有性状，无异常气味与异物；取样部位视相关产品使用说明而定，从每件样品上裁取2块尺寸为(20±2)mm×(30±2)mm的样片，每组试验样品选择一组对照样品作为参照物并有效标识，实验前将各组样品分别放入48个无菌平皿中备用；3.根据权利要求1所述的一次性卫生用品真菌杀灭效果的评价方法，其特征在于，所述的设备选型及试剂、培养基配制，按下述步骤进行：(1)通用要求：试验用分析纯试剂及符合GB/T6682-2008规定的三级水(蒸馏水或去离子水)，实验室具备二级生物安全资质，人员具有正规微生物实验室工作经验；(2)仪器设备：二级生物安全柜或洁净等级不低于100的超净工作台；含ATP荧光光度计、专用试管等的ATP生物荧光快速检测系统，ATP荧光光度计波长量程300nm～650nm，ATP浓度检测范围10-11mol/L～10-6mol/L；放大倍数40×～400×的生物光学显微镜；(25～37)℃±1℃的恒温培养箱；(10～50)℃±1℃的恒温水浴箱；(0～50)℃±1℃、(50～300)r/min的恒温振荡器；转速≥8000r/min的离心机及配套离心管；转速(500～3000)r/min的旋涡振荡器；(121±2)℃、(103±5)kPa的压力蒸汽灭菌器；-20℃～-80℃的低温冰箱；0℃～10℃的冷藏箱；感量0.001g的电子天平；频率(30～50)kHz的超声波清洗器；精度±0.1(25℃)的pH计；电炉；(3)材料器具：血球计数板及专用盖玻片；1mL、10mL的无菌刻度吸管；0.05mL、0.1mL、0.2mL、1mL、5mL、10mL(计量误差＜1％)的单道可变量程移液枪和无菌移液枪头；容量100mL、250mL、500mL的无菌锥形瓶及瓶塞；无菌培养皿；玻璃漏斗；无菌旋塞试管；直径≤4mm的接种环；直径5mm的玻璃珠；酒精灯；灭菌镊子、剪刀；用于生化检测的药棉和纱布；无菌滤纸；的温度计；精度0.01s的秒表；(4)试剂：0.1％的吕氏碱性美蓝染色液；以下试剂121℃高压灭菌30min，5℃～10℃存放30d：85％的生理盐水；N一甲基乙磺酸、吐温80、二辛磺化丁二酸钠任选一种，配制成0.05％的润湿剂水溶液；将5g硫代硫酸钠溶于1000mL水(用于含氯型杀菌剂样品)；将1.36g磷酸二氢钾、2.83g磷酸氢二钠、10g卵磷脂、10g甘氨酸、30g吐温(80)溶于1000mL水或将1.36g磷酸二氢钾、2.83g磷酸氢二钠、3g卵磷脂、20g吐温(80)溶于1000mL水(用于含非氧化型杀菌剂样品)；将20g吐温(80)、1g硫代硫酸钠溶于1000mL磷酸盐缓冲溶液(用于含氧型杀菌剂样品)等(或针对待测一次性卫生样品所含杀菌剂类型，选择其他相适用的中和剂)；(5)培养基/液(可用市售培养基/液)：所配培养基/液分装后121℃高压灭菌30min，2℃～8℃存放30d；沙氏培养基/液(白色念珠菌的菌种活化用)：将40g葡萄糖、10g蛋白胨、20g琼脂加热溶解于1000mL水中(培养液不加琼脂)，调节pH至5.6±0.2(25℃)；察氏培养液(霉菌孢子液制备、菌悬液稀释及样品洗脱用)：将2g硝酸钠、1g磷酸氢二钾、0.5g氯化钾、0.5g硫酸镁、0.01g硫酸亚铁、30g蔗糖加热溶解于1000mL含0.05％润湿剂的水溶液中，调节pH至6.0～6.5(25℃)；马铃薯一葡萄糖培养基(霉菌孢子菌种活化用):将300g新鲜马铃薯去皮切块，在1000mL水中煮沸20min～30min；过滤取汁，向滤液中加入20g葡萄糖、0.1g氯霉素、20g琼脂后定容至1000mL；(6)ATP荧光反应试剂(或用市售试剂)：除磷酸盐缓冲溶液外，所配ATP荧光反应试剂-20℃～-70℃保存，6个月内使用；稀释缓冲溶液：0.005mol/L且含0.037％蔗糖的磷酸氢二钠溶液，调节pH至7.2±0.2；121℃高压灭菌15min，2℃～8℃存放30d；ATP荧光试剂缓冲溶液：将1117mg三羟甲基氨基甲烷、183mg乙二胺四乙酸二钠、808mg乙酸镁、6.7mg二巯基苏糖醇、25000mg的β-环糊精和925mg葡萄糖加热溶解于250mL水中，调节pH至7.5±0.2；8h内使用；ATP裂解液：将4.6国际单位/ml的三磷酸腺苷双磷酸酶(EC:3.6.1.5)和46国际单位/ml的磷酸腺苷脱氨酶(EC:3.5.4.6或EC:3.5.4.17)、37mg蔗糖、20mg牛血清蛋白溶解于10mL浓度为0.05mol/L的2-吗啉乙磺酸缓冲溶液中，调节pH至6.0±0.5，8h内使用(1mL裂解液在15min内可将沙氏培养液中的ATP浓度降至10-11mol/L以下)；ATP提取液：将45mg三羟甲基氨基甲烷加热溶解于9.8ml水中，与0.2ml浓度为10％的苯扎氯铵溶液混匀后，调节pH至12.0±0.5(真菌细胞ATP提取效率不低于80％)；ATP荧光试剂：将0.7mg荧光素酶、12.6mg的D-荧光素、56mg牛血清蛋白溶解于30mL的ATP荧光试剂缓冲溶液，混匀后室温静置15min，3h内使用；4.根据权利要求1所述的一次性卫生用品真菌杀灭效果的评价方法，其特征在于，所述的菌种保藏、活化及菌悬液制备，按下述步骤进行：(1)试验菌种：白色念珠菌ATCC10231；黑曲霉ATCC16404；球毛壳霉ATCC6205；产黄青霉ATCC9179(或由国家微生物菌种保藏中心提供并可溯源的其他菌种)；(2)菌种保藏：白色念珠菌——以无菌操作打开冻干菌种管，用毛细吸管向管内注入适量沙氏培养液，吹吸数次使菌种融化分散；将少许菌种悬液滴入装有5mL～10mL沙氏培养液的试管中，37℃培养18h～24h，霉菌——以无菌操作将霉菌试验菌种接种于马铃薯—葡萄糖培养基斜面并标明接种日期，28℃～30℃培养至斜面长满霉菌孢子(7d～14d)；3℃～10℃保藏4个月，作为保藏菌；(3)菌种活化：白色念珠菌——用接种环刮取第1代培养物中的典型菌落，划线接种于沙氏培养基平板；37℃培养18h～24h后，挑取第2代培养物中的典型菌落接种于沙氏培养基斜面；37℃培养18h～24h后，4℃密封存放，6周内使用，霉菌——用接种环刮取保藏菌孢子，接种马铃薯—葡萄糖培养基斜面，28℃～30℃培养7d～14d，直至生成大量孢子，制备孢子悬浮液前不得拔出霉菌菌种的试管塞，每支试管打开后只供制备一次孢子液，每次均使用新培养的霉菌孢子制备悬液；(4)菌悬液制备：白色念珠菌试验——用接种环从斜面上挑取新鲜菌种培养物接种于装有50mL沙氏培养液的无菌锥形瓶中，置于(30±1)℃的恒温振荡器内150r/min培养18h～24h，4℃密封存放，当天使用，霉菌试验——向菌种试管中加入10mL的无菌水，用接种环轻刮培养基表面的新鲜霉菌孢子，将洗出的孢子原液注入装有15粒玻璃珠和45mL察氏培养液的无菌加塞锥形瓶中，3000r/min振摇试管2min，打散孢子团，混匀孢子液，然后，将覆有无菌药棉或八层纱布的玻璃漏斗置于锥形瓶上，过滤孢子悬浮液除去菌丝和培养基碎片；将滤液移至灭菌离心管中，室温下8000r/min分离处理至少10min，去上清液；再用50mL察氏培养液清洗孢子沉淀物并离心，重复清洗3次后，用察氏培养液稀释离心后的孢子沉淀物，每种试验霉菌均按照上述方法制备孢子悬液，并将各菌种的孢子液等体积混合；0℃～7℃存放，当天或4d内使用；5.根据权利要求1所述的一次性卫生用品真菌杀灭效果的评价方法，其特征在于，所述的美蓝染色后菌悬液活菌含量CB的血球板计数，按下述步骤进行：(1)美蓝染色：以无菌操作将50μL稀释度为10-2～10-3的白色念珠菌悬浮液或霉菌混合孢子液和30μL浓度为0.05％的吕氏碱性美蓝染色液分别移至同一支无菌试管中(菌液稀释度以血球计数板每个小方格内含4～5个白色念珠菌细胞或霉菌孢子为宜)，1000r/min振摇试管1min，使菌悬液与染色液充分混匀；(2)血球板计数：用无菌吸管将5μL±0.5μL染色后的菌悬液置于盖玻片边缘，使其沿玻片间隙缓慢渗入血球计数板，计数板与玻片之间不可产生气泡，否则重新操作，用无菌滤纸吸净槽中多余菌液，静置2min±20s，使其全部沉降至计数室内，当使用16中格计数板时,在对角线方位取左上、右上、左下、右下4个中格(即100个小方格)内的白色念珠菌细胞或霉菌孢子进行计数；如使用25中格计数板,除计数上述4个对角方位外,还需计数中央的1个中格(即80个小方格)；当试验菌种位于中格的双线上时，则只计数上线和右线或下线和左线上的白色念珠菌细胞或霉菌孢子；(3)活菌含量CB计算：将生物光学显微镜放大倍数自低向高调至400×后，立即对血球计数板相应空间位置处的白色念珠菌细胞或霉菌孢子进行计数；其中无色的白色念珠菌细胞为活菌，蓝色或淡蓝色者为死菌；边缘呈深蓝色、内部呈无色或淡蓝色及淡红色的霉菌孢子为活菌，边缘与内部均呈深蓝色者为死菌，故只计数边缘与内部颜色不同的孢子，若霉菌孢子悬液中无菌丝单孢子的数量低于90％，则重新制备孢子液，对血球计数板每个小方格中的白色念珠菌细胞或霉菌孢子重复镜检计数三次，取平均值，当血球计数板规格为16×25时，1mL菌液的活菌含量(菌落形成单位每毫升，CFU/mL)CB＝N÷5×16×K×104；当血球计数板规格为25×16时，CB＝N÷5×25×K×104；其中N为血球计数板五个中格内白色念珠菌细胞或霉菌孢子的活菌总数，K为菌液稀释倍数，然后，用察氏培养液将已知活菌含量CB的白色念珠菌悬浮液或霉菌混合孢子液稀释为5.0×108CFU/mL～9.0×108CFU/mL；6.根据权利要求1所述的一次性卫生用品真菌杀灭效果的评价方法，其特征在于，所述的ATP浓度对数值lgCA-相对荧光强度对数值lgIA标准曲线建立及接种菌液活菌ATP浓度CA标定，按下述步骤进行：(1)ATP标准系列溶液的确定及其测试样制备：用ATP荧光试剂缓冲溶液将1.0×10-3mol/L的ATP标准原液稀释为高、低浓度标准系列溶液：7.0×10-8mol/L、7.0×10-7mol/L、7.0×10-6mol/L和1.4×10-9mol/L、1.4×10-8mol/L、1.4×10-7mol/L并充分混匀，然后，用灭菌移液枪将0.1mL上述ATP标准溶液分别移至三只无菌试管中，依次滴加0.05mL无菌水和0.35mL生理盐水溶液并混匀，作为一级ATP标准溶液测试样；再将0.1mL一级ATP标准溶液测试样分别移至三支无菌试管中，各滴加0.4mL生理盐水并混匀，作为二级ATP标准溶液测试样；并用灭菌移液枪将0.1mL不同浓度的二级ATP标准溶液测试样分别移至三支仪器专用无菌试管中，作为ATP标准溶液测试平行样；(2)空白本底值校准：用灭菌移液枪将0.1mL含0.05％润湿剂的水溶液、0.35mL生理盐水和0.05mL的ATP裂解液分别加入同一支无菌试管中，3000r/min振摇试管30s；静置10min～20min后作为一级空白样；再将0.1mL一级空白样移至另外一支无菌试管中，滴加0.4mL生理盐水并混匀，作为二级空白样，然后，用灭菌移液枪将0.1mL二级空白样分别移至三支仪器专用无菌试管中，作为空白测试平行样；向三个平行样中依次滴加0.1mL的ATP提取试剂，混匀后再滴入0.1mL的ATP荧光试剂，3000...
【专利技术属性】
技术研发人员：李文杰，靳慧达，娄巧哲，连素梅，崔宗岩，
申请(专利权)人：李文杰，
类型：发明
国别省市：河北,13
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