ATP生物荧光lgCB-lgIB标准曲线法检测抗菌涂料防霉性能的方法技术

本发明专利技术涉及一种抗菌涂料防霉性能检测方法，检测步骤包括：样品提取、制备及前处理；设备选型及试剂、培养基配制；菌种保藏、活化及菌悬液制备；OD值‑活菌含量对数值lgCB标曲建立及接种菌液CB标定；lgCB‑相对荧光强度对数值lgIB标准曲线建立；样品接种、培养及洗脱回收；回收液IB测定及其活菌含量CB和TB推算；抗菌率R或抗菌活性值A计算；结果评价；其特别之处在于：应用ATP荧光光度计对以R或A表征的涂料防霉性能进行精准定量测试。本发明专利技术规定洗脱回收接触0h及培养48h后的对照样品和抗菌样品，测定回收液IB并以lgIB表征和计算R或A；提供结果评价依据。本发明专利技术研发的抗菌涂料防霉性能检测的ATP生物荧光lgCB‑lgIB标曲法，将以科学先进的检测技术支撑产品质量提升。

Standard Curve Method of ATP Biofluorescence lgCB-lgIB for Detecting Anti-mildew Property of Antibacterial Coatings

【技术实现步骤摘要】
ATP生物荧光lgCB-lgIB标准曲线法检测抗菌涂料防霉性能的方法
本专利技术涉及抗菌涂料的防霉性能测试方法，具体是一种应用ATP荧光光度计对以抗菌率R或抗菌活性值A表征的抗菌涂料防霉性能进行精准定量检测的ATP生物荧光lgCB-lgIB标准曲线法，属于涂料抗菌功能检测

技术介绍
伴随着人们生活水平的提高和健康意识的增强，室内环境及家居装修质量备受关注，抗菌涂料因此应运而生且供不应求；据统计，2017年全球抗菌涂料产量已逾40万吨；相关机构ZionResearch最新研究报告显示，2020年国际抗菌涂料市场预计将突破50亿美元，复合年平均增长率为9％。可见抗菌技术在涂料产业的应用和普及势不可挡，抗菌功能已成为涂料产品极具特色的一个“卖点”；但现有检测技术的滞后却严重制约着产业发展。目前，国内外抗菌材料性能检测技术体系主要针对细菌和真菌，其中防霉检测方法基本源自美标、日标和欧标，所涉标准主要包括国外基于土埋培养法、琼脂平板法和湿室培养法的ISO846:1997《塑料制品的抗菌培养评估》、DIN53793《抗菌高分子材料的抗真菌测定方法》和国内侧重于平皿培养法和悬挂法的GB/T1741-2007《漆膜耐霉菌性测定法》、GB/T24346-2009《纺织品防霉性能的评价》、GB/T24128-2009《塑料防霉性能试验方法》、QB/T4199-2011《皮革防霉性能测试方法》、HG/T4301-2012《橡胶防霉性能测试方法》、LY/T2230-2013《人造板防霉性能评价》等。总体而言，现有防霉性能检测方法在
技术实现思路
和实际应用中存在以下共性问题：一是由于霉菌孢子生长过程中形成的菌丝体无法准确计数，只能进行定性判定，无法定量测试；二是因霉菌生长周期较长，培养时间至少2周～4周，导致测试周期较长，时间及经济成本高；三是实验过程繁琐，技术难度较高；相关操作受人为因素影响大，使得测试误差大，缺乏可比性。近年来，在国际细菌检测
ATP荧光分析法发展日益成熟，与传统平皿法相比检测结果相关性为98％，准确度高且可实现快速检测。受需求牵引，国外抗菌材料性能检测技术研究领域针对当前定量化、快速化和简易化发展趋势，已借鉴ATP荧光分析原理制定ISO20743:2007-2013《Textiles-Determinationofantibacterialactivityoftextileproducts(纺织品-抗菌整理纺织品的抗细菌性能测定)》和ISO13629-1:2012《Textiles-Determinationofantifungalactivityoftextileproducts.Part1Luminescence(纺织品-抗菌整理纺织品的防霉性能测定)》，规定了以样品接种后ATP含量变化表征抗细/霉菌性能的荧光测定法，但其仅适用于具有吸水性且对照样细/霉菌增长值＞0的纺织材料或微孔材料，在活菌回收方式、试验有效条件等关键技术方面不适用于具有非吸水性硬质表面且对照样细菌增长值＜0的建材、金属等涂料底板材料；同时未提供明确的结果计算公式和测量不确定度评估。另外，该标准方法相关抗菌性能表征参数相对单一，仅涉及抗菌活性值A，而我国则惯用抗菌率R。因此，为抵御国外技术壁垒，规范国内市场秩序，推动产业转型升级，亟待研究科学先进、准确性和重现性高、简便易行的抗菌涂料性能测试技术。本专利技术路线设计接轨国际，检测方法属全球首创，可有效填补国内外相关
空白。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是提供一种应用ATP荧光光度计对以抗菌率R或抗菌活性值A表征的抗菌涂料防霉性能进行检测的ATP生物荧光lgCB-lgIB标准曲线法，能够解决抗菌涂料乃至其他产品领域抗菌材料及制品防霉性能精准定量测试问题。为解决上述技术问题，本专利技术采用的技术方案是：一种抗菌涂料防霉性能的检测方法，包括：(1)样品提取、制备及前处理；(2)设备选型及试剂、培养基配制；(3)菌种保藏、活化及孢子悬液制备；(4)OD值-活菌含量对数值lgCB标准曲线建立及接种孢子液CB标定；(5)活菌含量对数值lgCB-相对荧光强度对数值lgIB标准曲线建立；(6)样品接种、培养及洗脱回收；(7)回收液相对荧光强度值IB测定；(8)回收液活菌含量CB和TB推算及抗菌率R和抗菌活性值A计算；(9)结果评价；其特征在于，应用ATP荧光光度计对以抗菌率R或抗菌活性值A表征的抗菌涂料防霉性能进行精准定量测试的ATP生物荧光lgCB-lgIB标准曲线法，具体的：在回收液相对荧光强度值IB测定中：明确涂料样品提取以及对照样品和抗菌样品的制备、数量、尺寸、前处理等要求，将霉菌试验菌种的标准菌株进行传代、活化后，取新鲜霉菌孢子培养物制备孢子悬液；应用MTT比色分析法建立OD值-活菌含量对数值lgCB标准曲线，推导得出曲线的线性方程式Y＝a0X+b0及相关系数R02。对不同稀释度的孢子悬液进行活菌含量CB标定后，选择CB为2.1×103CFU/mL、2.1×104CFU/mL、2.1×105CFU/mL的孢子液作为标准系列菌悬液；测定其相对荧光强度值IB，绘制lgCB-lgIB标曲，并推导得出曲线的线性方程式Y＝aBX+bB及相关系数RB2。然后，选取活菌含量CB范围为5.0×105CFU/mL～9.0×105CFU/mL的混合孢子液作为接种菌液；向各组样品待测表面分别滴加0.3mL菌液，立即用4.6mL洗脱液对6组0h接触样品进行洗脱回收，测定回收液的相对荧光强度值IBC0ij、IBT0ij，根据lgCB-lgIB曲线方程式Y＝aBX+bB推算其活菌含量CBOij和TBOij。同时，将6组密封于无菌平皿内的对照样品及抗菌样品在(28±2)℃、(95±2)％RH的条件下培养48h±2h后；采用与0h接触样品相同的方式洗脱回收表面残留菌并测定回收液的相对荧光强度值IBCtij、IBTtij，推算相应的活菌含量CBtij和TBtij；在抗菌率R及抗菌活性值A计算中：根据标准曲线lgCB-lgIB的线性方程式Y＝aBX+bB，以0h接触及经48h培养后每件对照样品和抗菌样品回收液的相对荧光强度测定值和作为基础数据；在试验有效条件下，计算其霉菌增长值Fij、Gij以及抗菌率Rij和抗菌活性值Aij；对每组样品的Rij和Aij取算术平均值得到相应的Ri和Ai；每批抗菌涂料样品抗菌率R和抗菌活性值A为其3组样品Ri和Ai的算术平均值；并明确相关数据修约和测量不确定度要求；在结果评价中：参考卫生行业通用做法和相关抗菌产品标准要求，确定防霉性能分级判定标准；当某组(件)抗菌涂料样品的抗菌率Ri(Rij)或抗菌活性值Ai(Aij)与其他两组(四件)样品的防霉性能相比至少相差一个水平级时，重新提取一组(件)样品重复实验；计算其经ATP生物荧光lgCB─lgIB标准曲线法测得的抗菌率或抗菌活性值。如果前后两组(件)抗菌涂料样品防霉性能水平相同，则弃之；取另外两组(四件)剩余样品抗菌率Ri(Rij)或抗菌活性值Ai(Aij)的算术平均值作为该批次(组)抗菌涂料样品防霉性能的评价结果。采用上述技术方案的本专利技术，与现有技术相比，有益效果是：(1)先进性：应用现代精密仪器—ATP荧光光度计作为本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种抗菌涂料防霉性能的检测方法，包括：(1)样品提取、制备及前处理；(2)设备选型及试剂、培养基配制；(3)菌种保藏、活化及孢子悬液制备；(4)OD值‑活菌含量对数值lgCB标准曲线建立及接种孢子液CB标定；(5)活菌含量对数值lgCB‑相对荧光强度对数值lgIB标准曲线建立；(6)样品接种、培养及洗脱回收；(7)回收液相对荧光强度值IB测定；(8)回收液活菌含量CB和TB推算及抗菌率R和抗菌活性值A计算；(9)结果评价；其特征在于，应用ATP荧光光度计对以抗菌率R或抗菌活性值A表征的抗菌涂料防霉性能进行精准定量测试的ATP生物荧光lgCB‑lgIB标准曲线法，具体的：在回收液相对荧光强度值IB测定中：明确涂料样品提取以及对照样品和抗菌样品的制备、数量、尺寸、前处理等要求，将霉菌试验菌种的标准菌株进行传代、活化后，取新鲜霉菌孢子培养物制备孢子悬液；应用MTT比色分析法建立OD值‑活菌含量对数值lgCB标准曲线，推导得出曲线的线性方程式Y＝a0X+b0及相关系数R0

【技术特征摘要】
1.一种抗菌涂料防霉性能的检测方法，包括：(1)样品提取、制备及前处理；(2)设备选型及试剂、培养基配制；(3)菌种保藏、活化及孢子悬液制备；(4)OD值-活菌含量对数值lgCB标准曲线建立及接种孢子液CB标定；(5)活菌含量对数值lgCB-相对荧光强度对数值lgIB标准曲线建立；(6)样品接种、培养及洗脱回收；(7)回收液相对荧光强度值IB测定；(8)回收液活菌含量CB和TB推算及抗菌率R和抗菌活性值A计算；(9)结果评价；其特征在于，应用ATP荧光光度计对以抗菌率R或抗菌活性值A表征的抗菌涂料防霉性能进行精准定量测试的ATP生物荧光lgCB-lgIB标准曲线法，具体的：在回收液相对荧光强度值IB测定中：明确涂料样品提取以及对照样品和抗菌样品的制备、数量、尺寸、前处理等要求，将霉菌试验菌种的标准菌株进行传代、活化后，取新鲜霉菌孢子培养物制备孢子悬液；应用MTT比色分析法建立OD值-活菌含量对数值lgCB标准曲线，推导得出曲线的线性方程式Y＝a0X+b0及相关系数R02，对不同稀释度的孢子悬液进行活菌含量CB标定后，选择CB为2.1×103CFU/mL、2.1×104CFU/mL、2.1×105CFU/mL的孢子液作为标准系列菌悬液；测定其相对荧光强度值IB，绘制lgCB-lgIB标曲，并推导得出曲线的线性方程式Y＝aBX+bB及相关系数RB2，然后，选取活菌含量CB范围为5.0×105CFU/mL～9.0×105CFU/mL的混合孢子液作为接种菌液；向各组样品待测表面分别滴加0.3mL菌液，立即用4.6洗脱液对6组0h接触样品进行洗脱回收，测定回收液的相对荧光强度值IBC0ij、IBT0ij，根据lgCB-lgIB曲线方程式Y＝aBX+bB推算其活菌含量CBOij和TBOij，同时，将6组密封于无菌平皿内的对照样品及抗菌样品在(28±2)℃、(95±2)％RH的条件下培养48h±2h后；采用与0h接触样品相同的方式洗脱回收表面残留菌并测定回收液的相对荧光强度值IBCtij、IBTtij，推算相应的活菌含量CBtij和TBtij；在抗菌率R及抗菌活性值A计算中：根据标准曲线lgCB-lgIB的线性方程式Y＝aBX+bB，以0h接触及经48h培养后每件对照样品和抗菌样品回收液的相对荧光强度测定值和作为基础数据；在试验有效条件下，计算其霉菌增长值Fij、Gij以及抗菌率Rij和抗菌活性值Aij；对每组样品的Rij和Aij取算术平均值得到相应的Ri和Ai；每批抗菌涂料样品抗菌率R和抗菌活性值A为其3组样品Ri和Ai的算术平均值；并明确相关数据修约和测量不确定度要求；在结果评价中：参考卫生行业通用做法和相关抗菌产品标准要求，确定防霉性能分级判定标准；当某组(件)抗菌涂料样品的抗菌率Ri(Rij)或抗菌活性值Ai(Aij)与其他两组(四件)样品的防霉性能相比至少相差一个水平级时，重新提取一组(件)样品重复实验；计算其经ATP生物荧光lgCB─lgIB标准曲线法测得的抗菌率或抗菌活性值，如果前后两组(件)抗菌涂料样品防霉性能水平相同，则弃之；取另外两组(四件)剩余样品抗菌率Ri(Rij)或抗菌活性值Ai(Aij)的算术平均值作为该批次(组)抗菌涂料样品防霉性能的评价结果。2.根据权利要求1所述的抗菌涂料防霉性能的检测方法，其特征在于，所述的样品提取、制备及前处理，按下述步骤进行：(1)涂料样品提取：本专利方法所涉涂料样品为建筑和木器用抗菌涂料，包括液态或加热时可液化但不发生化学变化以及粉状、粒状、膏状的色漆和清漆物料；取样地点涵盖罐、柱状桶、贮槽、集装箱、槽车/槽船以及鼓状桶、袋、大包、贮仓、贮仓车或传送带等场所，取样由具备相关经验人员参照GB/T3186-2006《色漆、清漆和色漆与清漆用原材料取样》中有关规定，根据待测涂料类别、聚集状态及容器大小，选择适用类型和规格的清洁器具提取至少2kg或抗菌试验所需量3～4倍的样品，当涂料存放于鼓状桶、柱状桶、袋等小容器时，如果交付批存在若干个容器，取样数量遵循GB/T3186-2006中表1的规定，否则从每个容器中各提取一件样品；若交付批由不同生产批容器组成，则从每个生产批容器中分别提取，当涂料存放于贮槽、公路槽车、贮仓、贮仓车、铁路槽车、槽船或平均高度至少1m的反应器等大容器时，对于均匀物料及搅拌或加热后可成为均匀物料的暂时性不均匀物料，上部样品可用取样勺或取样管提取，中部样品用浸人式罐提取，距液面十分之九深度处的底部样品用浸人式罐或区域取样器提取；如果大容器由几个隔段组成，从每个隔段中至少提取一件样品，并将所取单一样品混合成一件平均样品，对于永久性不均匀物料，至少提取2件样品，其中上层样品可用取样勺、下层样品用区域取样器、浸人式瓶(罐)或在容器底阀处取样；制备样品时将所取两层样品按照产品标准规定的配比称量混合成1件平均样品；取样结束后，使用旋转分样器将所提取的全部固、液体涂料样品充分混匀并分成15等分；其中固体样品每份500g，液体样品每份400mL，然后，将每份涂料样品分别放入带螺旋盖的罐、瓶、桶或塑料袋等容器中存放，其中金属容器配有密封金属盖，无焊料且内部不涂色漆和清漆(不用镀锌和铝质容器)；玻璃容器配有密封盖；(2)对照样品：除未添加任何抗菌防腐防霉成分外，对照样品的涂料类别、底板材质及制备方法、规格尺寸、试板厚度等均与抗菌样品完全相同，每个菌种试验使用6组样品；其中0h接触和48h培养试验各用3组，每组5件样品；(3)抗菌样品：添加抗菌成分的涂料试板，根据待测涂料样品的实际应用情况，可选择石棉水泥板、木质板、金属板、塑料板、玻璃板、贴膜纸板等底材；试板尺寸为(50±1)mm×(50±1)mm；其中钢板、铝板、马口铁板等金属试板厚度为1mm，木质试板厚度不大于10mm，矿石建筑板、石棉水泥板、复合木板、玻璃等材质试板厚度为1mm～10mm，所用试板表面平整、无锈、无油污，金属试板表面经磨砂纸打磨粗糙后，用75％的乙醇溶液擦拭2min；木质面板不取木心材且无树节，烘干后使用；按照GB/T1727-1992《漆膜一般制备法》要求制作漆膜，涂料施涂包括两次涂刷过程，第一次表干后再涂刷第二次，漆膜总厚度(湿膜)小于100μm；若以木板或纸板为底材，应确保漆膜封住整个木板，抗菌样品数量与对照样品相同，每组待测样品选择一组对照样品作为参照物并有效标识；(4)样品前处理：试板涂刷后置于(23±2)℃、(50±5)％RH的洁净环境中，彼此间距至少20mm；避免日光直射，自然状态下调节7d，直至试板涂膜完全干燥，试验前将各组对照样品和抗菌样品置于超净工作台上，紫外灭菌消毒5min；然后将其待测表面向上放入无菌平皿内，备用。3.根据权利要求1所述的抗菌涂料防霉性能的检测方法，其特征在于，所述的设备选型及试剂、培养基配制，按下述步骤进行：(1)通用要求：试验用分析纯试剂及符合GB/T6682-2008规定的三级水(蒸馏水或去离子水)，实验室具备二级生物安全资质，人员具有正规微生物实验室工作经验；(2)仪器设备：二级生物安全柜或洁净等级不低于100的超净工作台；含ATP荧光光度计、专用试管等的ATP生物荧光快速检测系统，ATP荧光光度计波长量程300nm～650nm，孢子总数检测范围101CFU/mL～105CFU/mL；波长范围400nm～760nm，读数范围0.0Abs～4.0Abs的酶标仪；放大倍数40×～400×的生物光学显微镜；(25～30)℃±1℃、(20～95)％RH±2％RH的恒温恒湿培养箱；46℃±1℃的恒温水浴箱；转速≥8000r/min的离心机及配套离心管；转速范围(500～3000)r/min的旋涡振荡器；(121±2)℃、(103±5)kPa的压力蒸汽灭菌器；-20℃～-80℃的低温冰箱；0℃～10℃的冷藏箱；感量0.001g的电子天平；频率范围(30～50)kHz的超声波清洗器；分样比率≥1:15的旋转分样器；精度±0.1(25℃)的pH计；电炉；(3)材料器具：血球计数板及专用盖玻片；1mL、10mL的无菌刻度吸管；0.05mL、0.1mL、0.2mL、1mL、5mL、10mL(计量误差小于1％)的单道可变量程移液枪和无菌移液枪头；滤膜孔径不大于0.45μm的针头式过滤器；容量100mL、250mL、500mL的无菌锥形瓶及瓶塞；96孔平底培养板；直径90mm的无菌培养皿；玻璃漏斗；无菌旋塞试管；直径不大于4mm的接种环；L棒；直径5mm的玻璃珠；酒精灯；灭菌镊子；医用胶带；生化检测用药棉和纱布；无菌滤纸；的温度计；精度0.01s的秒表；宽的漆刷或喷嘴内径的喷枪；适用的涂料取样器及存放容器；(4)试剂：75％的乙醇溶液；5mg/mL、pH值7.4的MTT(四甲基偶氮唑盐)溶液(0.45μm滤膜过滤除菌，4℃～6℃避光保存15d)；以下试剂分装后121℃高压灭菌30min，5℃～10℃存放30d：85％的生理盐水；N一甲基乙磺酸、吐温80、二辛磺化丁二酸钠任选一种，配制成0.05％的润湿剂水溶液；(5)培养基/液(可用市售培养基/液)：所配培养基/液分装后121℃高压灭菌30min，2℃～8℃存放30d；察氏培养液(霉菌孢子液制备、菌悬液稀释及样品洗脱用)：将2g硝酸钠、1g磷酸氢二钾、0.5g氯化钾、0.5g硫酸镁、0.01g硫酸亚铁、30g蔗糖加热溶解于1000mL含0.05％润湿剂的水溶液中，调节pH至6.0～6.5(25℃)；马铃薯一葡萄糖培养基(霉菌孢子菌种活化及其菌落总数平板计数用):将300g新鲜马铃薯去皮切块，在1000mL水中煮沸20min～30min；过滤取汁，向滤液中加入20g葡萄糖、0.1g氯霉素、20g琼脂后定容至1000mL；(6)ATP荧光反应试剂(或用市售试剂)：除磷酸盐缓冲溶液外，所配ATP荧光反应试剂-20℃～-70℃保存，6个月内使用；稀释缓冲溶液：0.005mol/L且含0.037％蔗糖的磷酸氢二钠溶液，调节pH至7.2±0.2；121℃高压灭菌15min，2℃～8℃存放30d；ATP荧光试剂缓冲溶液：将1117mg三羟甲基氨基甲烷、183mg乙二胺四乙酸二钠、808mg乙酸镁、6.7mg二巯基苏糖醇、25000mg的β-环糊精和925mg葡萄糖加热溶解于250mL水中，调节pH至7.5±0.2；8h内使用；ATP裂解液：将4.6国际单位/ml的三磷酸腺苷双磷酸酶(EC:3.6.1.5)和46国际单位/ml的磷酸腺苷脱氨酶(EC:3.5.4.6或EC:3.5.4.17)、37mg蔗糖、20mg牛血清蛋白溶解于10mL浓度为0.05mol/L的2-吗啉乙磺酸缓冲溶液中，调节pH至6.0±0.5，8h内使用(1mL裂解液在15min内可将沙氏培养液中的ATP浓度降至10-11mol/L以下)；ATP提取液：将45mg三羟甲基氨基甲烷加热溶解于9.8ml水中，与0.2ml浓度为10％的苯扎氯铵溶液混匀后，调节pH至12.0±0.5(霉菌细胞ATP提取效率不低于80％)；ATP荧光试剂：将0.7mg荧光素酶、12.6mg的D-荧光素、56mg牛血清蛋白溶解于30mL的ATP荧光试剂缓冲溶液，混匀后室温静置15min，3h内使用。4.根据权利要求1所述的抗菌涂料防霉性能的检测方法，其特征在于，所述的菌种保藏、活化及孢子悬液制备，按下述步骤进行：(1)试验菌种：黑曲霉ATCC16404；球毛壳霉ATCC6205；产黄青霉ATCC9179(或由国家微生物菌种保藏中心提供并可溯源的其他菌种)；(2)菌种保藏：以无菌操作将霉菌试验菌种接种于马铃薯—葡萄糖培养基斜面并标明日期，28℃～30℃培养至斜面长满霉菌孢子(7d～14d)；3℃～10℃保藏4个月；(3)菌种活化：用接种环刮取保藏菌孢子，接种马铃薯—葡萄糖培养基斜面，28℃～30℃培养7d～14d直至生成大量孢子，制备孢子悬浮液前不得拔出霉菌菌种试管塞，每支试管打开后只供制备一次孢子液，每次均使用新培养的霉菌孢子制备悬液；(4)孢子悬液制备：向菌种试管中加入10mL的无菌水，用接种环轻刮培养基表面的新鲜霉菌孢子，将洗出的孢子原液注入装有15粒玻璃珠和45mL察氏培养液的无菌加塞锥形瓶中，3000r/min振摇试管2min，打散孢子团，混匀孢子液，然后，将覆有无菌药棉或八层纱布的玻璃漏斗置于锥形瓶上，过滤孢子悬浮液除去菌丝和培养基碎片；将滤液移至灭菌离心管中，室温下8000r/min分离处理至少10min，去上清液；再用50mL察氏培养液清洗孢子沉淀物并离心，重复清洗3次后，用察氏培养液稀释离心后的孢子沉淀物，每种试验霉菌均按照上述方法制备孢子悬液，将各试验菌种的孢子液等体积混合；0℃～7℃存放，4d内使用。5.根据权利要求1所述的抗菌涂料防霉性能的检测方法，其特征在于，所述的OD值-活菌含量对数值lgCB标准曲线建立及接种孢子液CB标定，按下述步骤进行：(1)菌液OD值测定：采用血球计数板对混合孢子悬液的孢子总量进行初筛，用察氏培养液对浓度为6.0×108CFU/mL的混合孢子液进行1:10、1:15、1:20系列稀释，并以培养液作为空白对照样液，对酶标仪进行调零校正，然后，将100μL上述不同稀释度的孢子液分别注入96孔平底培养板，每个稀释度做3个复孔；向每孔滴加20μL的MTT溶液，(28±1)℃、(95±2)％RH培养30min后；在560nm～610nm波长范围内扫描最大吸收峰，确定最大吸收波长；测定各孔混和溶液的活菌OD值，不同稀释度孢子悬液的活菌OD值为其3个复孔OD测定值的算术平均值，同时，参照国标GB4789.15-2016规定的方法，对上述混合孢子悬液进行适当稀释后，在(28±1)℃培养3d，并对平皿进行菌落计数，标定其活菌含量CB；(2)OD值-活菌含量对数值lgCB标准...

【专利技术属性】
技术研发人员：李文杰，李海云，熊蕊，葛娜，崔宗岩，
申请(专利权)人：李文杰，
类型：发明
国别省市：河北,13