水稻杂交种的生产方法技术

本发明专利技术公开了一种水稻杂交种的生产方法，包括：步骤一、将线粒体信号肽的碱基序列、WA352基因序列和外源报告基因共同整合到野生型水稻染色体上，得到含有线粒体信号肽的碱基序列、WA352基因序列和外源报告基因的转基因不育株系，线粒体信号肽的碱基序列、WA352基因序列和外源报告基因连锁表达；步骤二、将转基因不育株系作为母本，以恢复系作为父本，进行杂交，获得F1代种子，带有外源报告基因的F1代种子为不育种子，剩余F1代种子为正常杂交水稻种子，用于生产。本发明专利技术打破不育基因和恢复基因的思想禁锢，使得雄性败育稳定彻底，不受环境条件影响，异交结实率高，是进行轮回选择的理想材料，使种质创新流程更加方便。

Production Method of Rice Hybrids

【技术实现步骤摘要】
水稻杂交种的生产方法
本专利技术属于水稻生产
，涉及一种水稻杂交种的生产方法。
技术介绍
水稻杂种优势利用是提高水稻产量最有效的途径。“三系法”杂交水稻受恢保关系限制对种质资源利用率低以及“两系法”杂交水稻受环境条件影响存在杂交制种安全是影响杂交水稻种植推广面积进一步扩大的重要因素。专利技术新的育种技术，开发出对种质资源利用率高、杂交制种安全的水稻杂种优势利用方法是杂交水稻发展的方向。一般认为，雄性不育系和恢复系的获得是杂种优势利用的关键。玉米和水稻杂交种生产技术体系都包括稳定的不育系和恢复系。相比较于“三系”“两系”等杂交种生产方法，以去雄为基础的杂交种生产更复杂一些。主要包括人工去雄和化学杀雄。人工去雄存在以下问题：劳动强度大，作业效率低，多次重复作业容易使抽雄人员疲劳。另外人工去雄作业成本高，对水稻商业化杂交种制种来说没有现实意义。化学杀雄成功的关键在于去雄的彻底性以保证杂交种的纯度以及提高异交授粉的效率以增加杂交种的产量。如果化学杀雄期间，天气不好，遇到下雨情况，就会严重影响去雄的效果；相反，化学杀雄期间，天气良好，温湿度适宜，父母本花期相遇且伴有轻微的风速就会促进开花和异花授粉，提高制种的产量。另外一个关键的时间点，就是化学杀雄试剂喷洒所对应的作物发育阶段，要在花药发育最敏感的时期，一般是指花粉母细胞减数分裂时期。在实际生产中，由于不能保证化学试剂喷洒的均匀性以及每株及不同分蘖之间发育时期的差异，即使喷洒多次，化学杀雄的彻底性也并不是很好，制种的纯度不能很好的保证。因此急需一种新的去雄方法，解决水稻等作物的杂交种生产技术瓶颈。
技术实现思路
本专利技术的一个目的是解决至少上述问题和/或缺陷，并提供至少后面将说明的优点。本专利技术还有一个目的是提供一种水稻杂交种的生产方法。为此，本专利技术提供的技术方案为：一种水稻杂交种的生产方法，包括：步骤一、将线粒体信号肽的碱基序列、WA352基因序列和外源报告基因共同整合到野生型水稻染色体上，得到含有线粒体信号肽的碱基序列、WA352基因序列和外源报告基因的转基因不育株系，其中，所述WA352基因序列如SEQIDNO:1所示，所述线粒体信号肽的碱基序列、WA352基因序列和外源报告基因连锁表达；步骤二、将所述转基因不育株系作为母本，以恢复系作为父本，进行杂交，获得F1代种子，带有所述外源报告基因的F1代种子为不育种子，剩余F1代种子为正常杂交水稻种子，可用于生产。优选的是，所述的水稻杂交种的生产方法中，所述线粒体信号肽的碱基序列如SEQIDNO:2所示。优选的是，所述的水稻杂交种的生产方法中，所述线粒体信号肽的碱基序列和WA352基因序列采用pUDT1序列调控，pUDT1启动子序列的碱基序列如SEQIDNO:3所示。优选的是，所述的水稻杂交种的生产方法中，所述外源报告基因由糊粉层特异启动子Ltp2调控表达，所述启动子Ltp2的的碱基序列如SEQIDNO:4所示。优选的是，所述的水稻杂交种的生产方法中，还包括：如SEQIDNO:7所示的碱基序列，其包含所述线粒体信号肽的碱基序列、WA352基因序列和外源报告基因的碱基序列，且两端分别有BglII和XhoI酶切位点。优选的是，所述的水稻杂交种的生产方法中，步骤一中，将如SEQIDNO:7所示的碱基序列构建到pCAMBIA1300载体上，得到pCAMBIA1300-WA352表达载体，然后将pCAMBIA1300-WA352表达载体通过农杆菌介导方法侵染水稻愈伤组织转化入野生型水稻的染色体上，以将线粒体信号肽的碱基序列、WA352基因序列和外源报告基因共同整合到野生型水稻染色体上。优选的是，所述的水稻杂交种的生产方法中，所述步骤二中，所述恢复系为发育正常的水稻常规品种，为水稻9311、华占或R900，用恢复系的花粉授给不育系后，所产生的杂交种子育性恢复正常，能自交结实，如果该杂交种有优势的话，经过一系列的试验示范程序，待品种审定后，就可用于生产。优选的是，所述的水稻杂交种的生产方法中，所述外源报告基因为红色荧光标记基因。优选的是，所述的水稻杂交种的生产方法中，通过PCR方法鉴定转基因T0代植株，PCR方法中采用的引物对如SEQIDNO:5和6所示。本专利技术至少包括以下有益效果：本专利技术通过合成生物学方法，利用绒毡层特异表达启动子pUTD1结合线粒体信号肽融合表达细胞质不育基因WA352，使线粒体基因WA352表达盒整合到核基因组上，利用其花粉败育功能实现生物去雄的效果。并连锁表达由糊粉层特异启动子Ltp2调控的荧光报告基因DsRed，利用其标记功能实现非转基因种子与转基因种子的精准色选。以转基因不育材料为母本，以优质恢复系为父本进行杂交，F1种子包含两种，带荧光的不育种子和非转基因的杂交种，通过色选可把两种种子分开，杂交种不含转基因成分，可用于生产。本专利技术为杂交种的生产提供了新的技术手段，并可推广到其他作物上去。本专利技术对杂交种生产技术进行创新的核心是打破不育基因和恢复基因的思想禁锢。通过细胞质不育基因WA352的精准调控，实现生物去雄的效果，利用荧光标记基因可把杂交种和不育种子分开，杂交种可用于生产，整个技术流程简单；在常规育种中，不育种子作为中间材料，雄性败育稳定彻底，不受环境条件影响，异交结实率高，是进行轮回选择的理想材料，使种质创新流程更加方便。本专利技术所创制的杂交种不含有转基因成分，可以避免现有的GMO(geneticmodifiedorganism)可能存在的应用风险，更容易为公众所接受。本专利技术新的育种技术为生产上作物杂交种生产提供新的思路，为作物杂种优势的利用揭开新的篇章。本专利技术的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本专利技术的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。附图说明图1为本专利技术其中一个实施例中的载体pUC57图谱；图2为本专利技术其中一个实施例中植物表达载体pCAMBIA1300图谱图3为本专利技术其中一个实施例中生产杂交水稻的流程示意图；图4为本专利技术其中一个实施例中PCR鉴定转基因不育株系的流程图；图5为本专利技术其中一个实施例中PCR鉴定转基因不育株系的凝胶图；图6为本专利技术其中一个实施例中转基因T0代株系的表型图；图7为本专利技术其中一个实施例中种子照片：7A转基因株系上收获的杂交种子(脱壳前)，7B为转基因株系上收获的杂交种子(脱壳后)，7C为转基因株系收获的杂交种子中的正常杂交种，7D为转基因株系收获的杂交种子中的带荧光种子，7E为正常杂交种植株花药的碘染结果，7F为带荧光种子植株花药的碘染结果。具体实施方式下面结合附图对本专利技术做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。应当理解，本文所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不配出一个或多个其它元件或其组合的存在或添加。如图1所示，本专利技术提供一种水稻杂交种的生产方法，包括：一种水稻杂交种的生产方法，包括：步骤一、将线粒体信号肽的碱基序列、WA352基因序列和外源报告基因共同整合到野生型水稻染色体上，得到含有线粒体信号肽的碱基序列、WA352基因序列和外源报告基因的转基因不育株系，其中，所述WA352基因序列如SEQIDNO:1所示，所述线粒体信号肽的碱基序列、WA352基因序列和外源报告基因连锁表达；步骤二、将本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种水稻杂交种的生产方法，其特征在于，包括：步骤一、将线粒体信号肽的碱基序列、WA352基因序列和外源报告基因共同整合到野生型水稻染色体上，得到含有线粒体信号肽的碱基序列、WA352基因序列和外源报告基因的转基因不育株系，其中，所述WA352基因序列如SEQ ID NO:1所示，所述线粒体信号肽的碱基序列、WA352基因序列和外源报告基因连锁表达；步骤二、将所述转基因不育株系作为母本，以恢复系作为父本，进行杂交，获得F1代种子，带有所述外源报告基因的F1代种子为不育种子，剩余F1代种子为正常杂交水稻种子，以生产杂交水稻。

【技术特征摘要】
1.一种水稻杂交种的生产方法，其特征在于，包括：步骤一、将线粒体信号肽的碱基序列、WA352基因序列和外源报告基因共同整合到野生型水稻染色体上，得到含有线粒体信号肽的碱基序列、WA352基因序列和外源报告基因的转基因不育株系，其中，所述WA352基因序列如SEQIDNO:1所示，所述线粒体信号肽的碱基序列、WA352基因序列和外源报告基因连锁表达；步骤二、将所述转基因不育株系作为母本，以恢复系作为父本，进行杂交，获得F1代种子，带有所述外源报告基因的F1代种子为不育种子，剩余F1代种子为正常杂交水稻种子，以生产杂交水稻。2.如权利要求1所述的水稻杂交种的生产方法，其特征在于，所述线粒体信号肽的碱基序列如SEQIDNO:2所示。3.如权利要求1所述的水稻杂交种的生产方法，其特征在于，所述线粒体信号肽的碱基序列和WA352基因序列由绒毡层特异表达启动子pUTD1序列调控，pUTD1启动子序列的碱基序列如SEQIDNO:3所示。4.如权利要求1所述的水稻杂交种的生产方法，其特征在于，所述外源报告基因由糊粉层特异启动子Ltp2调控表达，所述启动子Ltp2的的碱基序列如SEQ...

【专利技术属性】
技术研发人员：宋书锋，李莉，王天抗，李懿星，邱牡丹，许娜，
申请(专利权)人：湖南杂交水稻研究中心，
类型：发明
国别省市：湖南,43