一种渔用光合细菌制剂产品的检测方法技术

本发明专利技术公开了一种渔用光合细菌制剂产品的检测方法，该方法综合了双层平板培养法、显微计数法和高通量测序技术等多种技术，集成建立了针对渔用光合细菌制剂产品的菌量和纯度的测定方法；同时，根据光合细菌兼性厌氧和对光照要求等生理特征，及其利用水体无机氮磷营养的功能特性，进一步研究建立了渔用光合细菌制剂产品对水体氮磷作用效果的测定方法；并采用测定氮元素相关作用功能基因的方法确定菌剂的氮素转化功能潜力。

A Method for the Detection of Photosynthetic Bacteria Preparations for Fisheries

【技术实现步骤摘要】
一种渔用光合细菌制剂产品的检测方法
本专利技术属于光合细菌制剂
，具体涉及一种渔用光合细菌制剂产品的检测方法。
技术介绍
光合细菌(Photosyntheticbacteria)是一类能在厌氧条件下进行不产氧光合作用细菌的总称(杨素萍等，2008)，能以光作为能源，利用自然界中有机物、氨、硫化氢等作为供氢体进行光合作用。光合细菌为革兰氏阴性菌，菌体形态多样，有球状、杆状、螺旋状、半环形等，在10-45℃下均可生长繁殖，最适生长温度为20-30℃，最适pH为7.0-8.5(徐良梅等，2005)。此外，该类细菌具有广盐性(李卓佳等，2007)，光照强度是影响光合细菌生长的重要因素(徐良梅等，2005)。光合细菌具有多样化的代谢方式。光合细菌在厌氧条件下可进行光合作用，在黑暗微好氧和好氧条件下进行氧化代谢(史家梁等，1995；钱大益等，2005)。在氮代谢方面，它能同化氨氮、亚硝酸盐氮、硝酸盐氮等无机氮源，也可通过固氮作用将氮气转变为铵盐作为氮源(徐慧芳,2015)；在磷代谢方面，某些光合细菌具有较强的摄磷能力，但对磷的吸收能力受光照强度及pH等环境条件的影响(袁盈波等，2010)。有研究认为光合细菌具有硝化、反硝化等多种氮代谢方式(Yang,etal.,2017；Kim,etal.,1999)，其中参与硝化过程的关键酶是氨单加氧酶和亚硝酸盐氧化还原酶(刘华,2012；李敬源等,2012)，参与反硝化过程的关键酶是亚硝酸盐还原酶(王丽英,2005)。编码以上3种酶的基因分别为amoA、nxrA、nirS(李敬源等,2012)。目前将氮转化相关功能基因技术应用于光合细菌制剂质量检测与评价的报道还相对少见。光合细菌种类繁多但仅有一小部分在渔业生产中进行应用(Brandletal.,1989；杨莺莺等，2009)。当前用于渔用光合细菌制剂的常见细菌种类主要包括：红假单胞菌属(Rhodopseudomonas)(Jianetal.,2013；Zhouetal.,2007)、红螺菌属(Rhodospirillum)(Qietal.,2009)、外硫红螺菌属(Ectothiorhodospira)等(林启存等，2017)，其中应用最为普遍的为沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonaspalustris)(Zhangetal.,2014；Lazaroetal.,2017)。雷爱莹等(2005)从高产对虾养殖池塘底泥中分离获得到一株沼泽红假单胞菌，研究发现它能有效去除养殖水体中的氨氮、亚硝酸盐氮。此外，还有研究认为在渔用光合细菌生产中应用的主要菌种有红螺菌属、红假单胞菌属和红微菌属(201710561969.X)。光合细菌制剂是以培养基为原料、活性光合细菌为菌种，经过现代生物工程技术研制而成的微生物制剂。因其具有去除水环境中氨氮、亚硝酸盐氮等有害物质等功能，从20世纪80年代起已逐渐被广泛应用于水产养殖业。随着水产业的快速发展，光合细菌制剂成为研究热点之一。目前，市场上常见的光合细菌制剂产品多为5L～20L的深红色菌液。另有少量光合细菌冻干粉产品，但据检测分析该类冻干粉产品的主要优势菌为芽孢杆菌而并非光合细菌。因此，非常有必要对渔用光合细菌菌剂产品进行检测。但当前市场上渔用光合细菌制剂产品质量良莠不齐，作用效果难以保证，加之光合细菌制剂的使用环境复杂，菌种类别繁多(Kimetal.,2000；Shapleighetal.,2009)，检测光合细菌制剂产品在实际生产应用中的数量、纯度及应用效果存在一定的难度(杨官娥等，2010)。目前我国也尚无专门针对渔用微生态制剂产品的评价方法。光合细菌制剂在水产行业中没有专门性的标准，只有2个通用标准，即光合细菌制剂标准(NY527-2002)和光合细菌制剂中沼泽红假单胞菌计数方法(SN/T3542-2013)。前者规定的是光合细菌制剂的分类、技术要求、检验方法、检验规则、标志、包装、运输及贮存等，后者为光合细菌代表种数量测定方法参考。并且光合细菌制剂作用效果的评价和测定方法也暂鲜见报道。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种渔用光合细菌制剂产品的检测方法，该方法既可准确测定渔用光合细菌制剂产品中活菌与否、光合细菌菌量和纯度，还可测定渔用光合细菌制剂产品对水体氮磷的作用效果和渔用光合细菌制剂产品中氮元素相关作用功能基因含量。本专利技术的上述目的可以通过如下技术方案来实现：一种渔用光合细菌制剂产品的检测方法，该方法综合了双层平板培养法、显微镜计数法和高通量测序法，测定了渔用光合细菌制剂产品中活菌与否、菌量和纯度；待确定制剂产品中含有光合细菌后，进一步集成了渔用光合细菌制剂产品对水体氮磷作用效果和渔用光合细菌制剂产品中氮元素相关作用功能基因的测定方法，具体包括以下步骤：(1)采用双层平板培养法测定渔用光合细菌制剂产品中是否存在活菌，采用显微镜计数法测定渔用光合细菌制剂产品的总菌数，采用高通量测序法测定渔用光合细菌制剂产品的纯度；(2)如制剂产品中含有光合细菌，则一方面测定渔用光合细菌制剂产品对水体氮磷的作用效果；另一方面，对渔用光合细菌制剂产品中氮元素转化相关功能基因进行测定，确定其是否具有氮素转化功能潜力；如制剂产品中不含有光合细菌，则说明该制剂产品实际并非光合细菌菌剂产品，无需再进行该步骤。在上述渔用光合细菌制剂产品的检测方法中：优选的，步骤(1)具体包括以下步骤：(1.1)选取渔用光合细菌制剂样品，采用双层平板培养法测定是否存在活菌；(1.2)采用显微镜计数法测定菌剂中的总菌数；(1.3)提取渔用光合细菌制剂样品的总DNA，扩增16SrRNA可变区，采用高通量测序技术测定渔用光合细菌制剂样品的细菌群落组成，确定光合细菌的相对丰度，并计算出所检测光合细菌制剂样品中光合细菌的菌量和纯度。优选的，步骤(1.1)中采用双层平板培养法测定是否存在活菌时，包括以下步骤：选取渔用光合细菌制剂样品，制备稀释液，在30℃±1℃，光照微需氧条件下接种光合细菌培养琼脂双层平板，培养5～6d，观察双层平板上是否有菌生长，有菌生长，即说明该菌剂产品中有活菌；没有菌落生长，则说明该菌剂产品中没有活菌。优选的，步骤(1.3)中采用WaterDNAKit(水体DNA提取试剂盒，市售，Omega)提取渔用光合细菌制剂样品的细菌总DNA，扩增16SrRNA可变区，采用高通量测序技术测定菌剂的细菌群落组成，根据伯杰氏细菌鉴定系统确定检测结果中是否有光合细菌以及光合细菌的相对丰度，再根据总菌数和光合细菌的相对丰度获得光合细菌制剂样品中光合细菌的菌量和纯度。优选的，步骤(2)具体包括以下步骤：(2.1)对渔用光合细菌制剂样品净化养殖水体氮磷的作用效果进行检测和评价；(2.2)通过测定氮元素相关作用功能基因确定渔用光合细菌制剂样品的氮素转化功能潜力。优选的，步骤(2.1)中通过对渔用光合细菌制剂样品净化养殖水体氮磷的作用效果进行检测和评价包括：选择养殖水体，加入渔用光合细菌制剂样品，测试所述渔用光合细菌制剂产品对养殖水体中氨氮、亚硝酸盐氮、硝酸盐氮和磷酸盐的降解效果。优选的，步骤(2.2)所述氮元素相关作用功能基因包括编码氨单加氧酶的amoA基因、编码亚硝酸盐氧化还原酶的nxrA基因和编码亚硝酸盐还原酶的nirS本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种渔用光合细菌制剂产品的检测方法，其特征是：该方法综合了双层平板培养法、显微镜计数法和高通量测序法，测定了渔用光合细菌制剂产品中活菌与否、菌量和纯度；待确定制剂产品中含有光合细菌后，进一步集成了渔用光合细菌制剂产品对水体氮磷作用效果和渔用光合细菌制剂产品中氮元素相关作用功能基因的测定方法，具体包括以下步骤：(1)采用双层平板培养法测定渔用光合细菌制剂产品中是否存在活菌，采用显微镜计数法测定渔用光合细菌制剂产品的总菌数，采用高通量测序法测定渔用光合细菌制剂产品的纯度；(2)如制剂产品中含有光合细菌，则一方面测定渔用光合细菌制剂产品对水体氮磷的作用效果；另一方面，对渔用光合细菌制剂产品中氮元素转化相关功能基因进行测定，确定其是否具有氮素转化功能潜力；如制剂产品中不含有光合细菌，则说明该制剂产品实际并非光合细菌菌剂产品，无需再进行该步骤。

【技术特征摘要】
1.一种渔用光合细菌制剂产品的检测方法，其特征是：该方法综合了双层平板培养法、显微镜计数法和高通量测序法，测定了渔用光合细菌制剂产品中活菌与否、菌量和纯度；待确定制剂产品中含有光合细菌后，进一步集成了渔用光合细菌制剂产品对水体氮磷作用效果和渔用光合细菌制剂产品中氮元素相关作用功能基因的测定方法，具体包括以下步骤：(1)采用双层平板培养法测定渔用光合细菌制剂产品中是否存在活菌，采用显微镜计数法测定渔用光合细菌制剂产品的总菌数，采用高通量测序法测定渔用光合细菌制剂产品的纯度；(2)如制剂产品中含有光合细菌，则一方面测定渔用光合细菌制剂产品对水体氮磷的作用效果；另一方面，对渔用光合细菌制剂产品中氮元素转化相关功能基因进行测定，确定其是否具有氮素转化功能潜力；如制剂产品中不含有光合细菌，则说明该制剂产品实际并非光合细菌菌剂产品，无需再进行该步骤。2.根据权利要求1所述的渔用光合细菌制剂产品的检测方法，其特征是：步骤(1)具体包括以下步骤：(1.1)选取渔用光合细菌制剂样品，采用双层平板培养法测定是否存在活菌；(1.2)采用显微镜计数法测定菌剂中的总菌数；(1.3)提取渔用光合细菌制剂样品的总DNA，扩增16SrRNA可变区，采用高通量测序技术测定渔用光合细菌制剂样品的细菌群落组成，确定光合细菌的相对丰度，并计算出所检测光合细菌制剂样品中光合细菌的菌量和纯度。3.根据权利要求2所述的渔用光合细菌制剂产品的检测方法，其特征是：步骤(1.1)中采用双层平板培养法测定是否存在活菌时，包括以下步骤：选取渔用光合细菌制剂样品，制备稀释液，在30℃±1℃，光照微需氧条件下接种光合细菌培养琼脂双层平板，培养5～6d...

【专利技术属性】
技术研发人员：胡晓娟，曹煜成，苏浩昌，文国樑，徐煜，徐武杰，杨铿，信艳杰，许云娜，徐创文，洪敏娜，
申请(专利权)人：中国水产科学研究院南海水产研究所，
类型：发明
国别省市：广东,44