基于KASP技术开发的玉米核心SNP标记及其应用制造技术

本发明专利技术提供一套基于KASP技术开发的玉米核心SNP标记及其应用。本发明专利技术利用生物信息学方法从大量种质资源基因型数据中挑选出22个玉米核心SNP标记。利用该套SNP标记组合对玉米材料进行检测，更精准、高效。在DNA质量满足一般KASP反应(或常规PCR反应)需求的情况下，检测的准确度和分辨率均很高，检测效率是SSR标记的10‑20倍，检测成本与SSR标记相当，同时检测过程中无需使用丙烯酰胺等有毒化学试剂。此外，反应体系构建可实现自动化，将导出的数据输入计算机软件，可以实现一键分析。真正实现了高通量、低成本、自动化安全检测。

Core SNP Markers of Maize Based on KASP Technology and Their Application

【技术实现步骤摘要】
基于KASP技术开发的玉米核心SNP标记及其应用
本专利技术涉及分子生物学及植物分子育种领域，具体地说，涉及一种基于KASP技术开发的玉米核心SNP标记及其应用。
技术介绍
玉米纯度鉴定和品种区分是育种过程中的重要环节，同时也是玉米种子质量控制体系中的关键环节。目前玉米纯度鉴定和品种区分方法有形态鉴定、种子贮藏蛋白质电泳技术和DNA分子标记技术等。其中，简单重复序列(SimpleSequenceRepeats,SSR)标记具有多态性高、遗传上呈共显性和对参考序列要求较低等优点，因此根据上述技术制定的相关技术标准得到了广泛应用。随着分子生物学技术的发展，各育种企事业单位对分子标记辅助选择的需求日益迫切，而SSR标记基因组分布不够丰富以及需进行复杂的聚丙烯酰胺凝胶电泳检测等问题逐渐凸显，很难实现高通量低成本的分子标记辅助选择。竞争性等位基因PCR(kompetitiveallelespecificPCR，KASP)是一种基于荧光检测的基因分型技术。该技术现阶段主要被应用于SNP或InDel基因分型研究中，正逐渐成为分子辅助育种、性状基因的精细定位以及种子资源鉴定的主要技术手段。HaoHu等在《EvaluatinginformationcontentofSNPsforsample-tagginginresequencingprojects》中，从SNP信息熵的角度提出了一种挑选SNP标记用来区分人类个体的方法，并用Perl语言开发了SNP_Tagger.pl。基于此方法，用低至60个SNP标记就可以区分当前世界上所有人类的个体，而仅通过30个SNP标记就足以标记区分多达10万个以上个体。在作物育种领域，目前尚未见到基于KASP技术的一组分子标记来进行玉米纯度鉴定和品种区分。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种基于KASP技术开发的玉米核心SNP标记及其应用。为了实现本专利技术目的，第一方面，本专利技术提供一种基于KASP技术开发的玉米核心SNP标记，包括22个核心SNP标记，编号分别为LP0009、LP0014、LP0033、LP0068、LP0189、LP0191、LP0209、LP0221、LP0227、LP0242、LP0328、LP0368、LP0376、LP0425、LP0620、LP0629、LP0729、LP0749、LP0782、LP0787、LP0800和LP0902，它们的信息如下：表122个玉米核心SNP标记编号染色体SNP物理位置等位基因编号染色体SNP物理位置等位基因LP0009127883004[G/T]LP03683229172879[A/C]LP0014144333421[A/G]LP03769150002028[G/C]LP00331204846790[A/C]LP0425122595305[C/T]LP00681299049227[C/T]LP06204135185331[A/G]LP01894239761848[G/A]LP06294173239725[C/T]LP01914240048629[A/G]LP07296102987176[A/T]LP0209513238813[T/C]LP07496163214059[A/C]LP0221595037309[A/G]LP07827136902532[A/C]LP02275172852124[G/A]LP07877167378729[A/G]LP02425215561608[T/C]LP0800870028786[A/G]LP0328819858353[C/G]LP090210144409391[A/G]上述SNP物理位置是基于玉米B73的全基因组序列确定的，玉米B73全基因组序列的版本号为APGv3。第二方面，本专利技术提供用于扩增上述玉米核心SNP标记的KASP引物，22个核心SNP标记LP0009、LP0014、LP0033、LP0068、LP0189、LP0191、LP0209、LP0221、LP0227、LP0242、LP0328、LP0368、LP0376、LP0425、LP0620、LP0629、LP0729、LP0749、LP0782、LP0787、LP0800和LP0902分别依次通过以下引物扩增得到：SEQIDNO:1-3，SEQIDNO:4-6，SEQIDNO:7-9，SEQIDNO:10-12，SEQIDNO:13-15，SEQIDNO:16-18，SEQIDNO:19-21，SEQIDNO:22-24，SEQIDNO:25-27，SEQIDNO:28-30，SEQIDNO:31-33，SEQIDNO:34-36，SEQIDNO:37-39，SEQIDNO:40-42，SEQIDNO:43-45，SEQIDNO:46-48，SEQIDNO:49-51，SEQIDNO:52-54，SEQIDNO:55-57，SEQIDNO:58-60，SEQIDNO:61-63，SEQIDNO:64-66。第三方面，本专利技术提供含有上述KASP引物的检测试剂、试剂盒或芯片。第四方面，本专利技术提供所述22个玉米核心SNP标记或所述KASP引物的以下任一应用：(1)用于构建玉米品种DNA指纹数据库；(2)用于玉米种质资源遗传多样性分析；(3)用于玉米分子标记辅助育种；(4)用于玉米品种鉴定；(5)用于制备玉米基因组芯片。前述应用包括以下步骤：1)提取待测玉米基因组DNA；2)向步骤1)提取的DNA模板中加入特异的KASPPrimermix和通用的KASPMastermix，进行PCR扩增；3)采用荧光检测仪分析PCR扩增产物。其中，所述KASPPrimermix中含有三条特异性引物：引物F、H和C，各SNP标记的引物序列都是按照F、H和C顺序一一对应。所述KASPMastermix包含如下各组分：通用的FRETcassette荧光引物，ROX内参染料，KlearTaqDNA聚合酶，dNTP和MgCl2。步骤2)中引物F的5’端添加FAM荧光标签序列5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-3’，引物H的5’端添加HEX荧光标签序列5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-3’。优选地，步骤2)所述KASPPrimermix中引物F、H和C的浓度分别为步骤2)中所用PCR反应体系如下：384孔板中每孔加入100μMKASPPrimermix0.02-0.022μl、2×KASPMastermix0.6-0.9μl和DNA模板0.6-0.9μl。步骤2)中所用PCR反应条件如下：90-95℃预变性10-20分钟；第一步扩增反应，90-95℃变性10-30秒，退火并延伸30-90秒，5-20个TouchDown循环，每个循环退火及延伸的温度降低0.1-3.0℃；第二步扩增反应，90-95℃变性10-30秒，57-60℃退火并延伸30-90秒，20-35个循环。优选地，所用PCR反应体系如下：384孔板中每孔加入100μMKASPPrimermix0.022μl、2×KASPMastermix0.8μl和DNA模板0.8μl。PCR反应条件如下：94℃预变性15分钟；第一步扩增反应，94℃变性20秒，61℃～55℃退火并延本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.基于KASP技术开发的玉米核心SNP标记，其特征在于，包括22个核心SNP标记，编号分别为LP0009、LP0014、LP0033、LP0068、LP0189、LP0191、LP0209、LP0221、LP0227、LP0242、LP0328、LP0368、LP0376、LP0425、LP0620、LP0629、LP0729、LP0749、LP0782、LP0787、LP0800和LP0902，它们的信息如下：

【技术特征摘要】
1.基于KASP技术开发的玉米核心SNP标记，其特征在于，包括22个核心SNP标记，编号分别为LP0009、LP0014、LP0033、LP0068、LP0189、LP0191、LP0209、LP0221、LP0227、LP0242、LP0328、LP0368、LP0376、LP0425、LP0620、LP0629、LP0729、LP0749、LP0782、LP0787、LP0800和LP0902，它们的信息如下：编号染色体SNP物理位置等位基因编号染色体SNP物理位置等位基因LP0009127883004[G/T]LP03683229172879[A/C]LP0014144333421[A/G]LP03769150002028[G/C]LP00331204846790[A/C]LP0425122595305[C/T]LP00681299049227[C/T]LP06204135185331[A/G]LP01894239761848[G/A]LP06294173239725[C/T]LP01914240048629[A/G]LP07296102987176[A/T]LP0209513238813[T/C]LP07496163214059[A/C]LP0221595037309[A/G]LP07827136902532[A/C]LP02275172852124[G/A]LP07877167378729[A/G]LP02425215561608[T/C]LP0800870028786[A/G]LP0328819858353[C/G]LP090210144409391[A/G]上述SNP物理位置是基于玉米B73的全基因组序列确定的，玉米B73全基因组序列的版本号为APGv3。2.用于扩增权利要求1所述玉米核心SNP标记的KASP引物，其特征在于，22个核心SNP标记LP0009、LP0014、LP0033、LP0068、LP0189、LP0191、LP0209、LP0221、LP0227、LP0242、LP0328、LP0368、LP0376、LP0425、LP0620、LP0629、LP0729、LP0749、LP0782、LP0787、LP0800和LP0902分别依次通过以下引物扩增得到：SEQIDNO:1-3，SEQIDNO:4-6，SEQIDNO:7-9，SEQIDNO:10-12，SEQIDNO:13-15，SEQIDNO:16-18，SEQIDNO:19-21，SEQIDNO:22-24，SEQIDNO:25-27，SEQIDNO:28-30，SEQIDNO:31-33，SEQIDNO:34-36，SEQIDNO:37-39，SEQIDNO:40-42，SEQIDNO:43-45，SEQIDNO:46-48，SEQIDNO:49-51，SEQIDNO:52-54，...

【专利技术属性】
技术研发人员：马丽，钟敬，应继锋，沈志成，刘法新，张立阳，郑秀婷，张先文，阮祥经，林海艳，傅军，刘欢，
申请(专利权)人：袁隆平农业高科技股份有限公司，浙江大学，
类型：发明
国别省市：湖南,43