一种外植体灭菌试剂及其制备方法技术

本发明专利技术属于生物技术领域，特别涉及一种外植体灭菌试剂及其制备方法。本发明专利技术将新鲜艾蒿叶片、新鲜芦荟叶片和新鲜洋葱按照质量比(1～5)：(1～5)：(1～5)混合，粉碎后加入茶树油10～20ml，用蒸馏水定容至500～1000ml，静置浸提12～24h的过滤液，即得灭菌试剂。本发明专利技术以生长季的嫩梢、花瓣、花蕾、叶片、种子为外植体，应用上述试剂的杀菌作用，成功地建立起苹果、蓝莓、迷你蝴蝶兰、月季、广藿香等植物组织培养接种前外植体灭菌技术体系，灭菌效果显著且稳定。以实现外植体灭菌试剂对环境的无毒、无害、无副作用，保护生态环境。

【技术实现步骤摘要】
一种外植体灭菌试剂及其制备方法
本专利技术属于生物
，特别涉及一种外植体灭菌试剂及其制备方法。
技术介绍
外植体灭菌是植物组织培养能够成功的一个重要环节。传统上，植物组织培养时，常用的外植体灭菌方法是：外植体在70％或75％乙醇中浸泡不超过30s，然后再用次氯酸钠(NaOCl)或次氯酸钙[Ca(OCl)2]或升汞(氯化汞，HgCI2)进一步杀菌，才能收到较好的外植体灭菌效果。升汞的常用浓度0.1％，处理时间10～15min，杀菌效果好，但残毒高。消毒后需用无菌水冲洗3～5次；次氯酸钠和次氯酸钙常用浓度可为0.5％～10％，杀菌时间5～30min，杀菌效果比较好，对植物无害；但次氯酸钠和次氯酸钙或多或少具有一定的毒性。且此类化学试剂成本较高。
技术实现思路
为弥补现有技术的空白，本专利技术提供一种外植体灭菌试剂及其制备方法，该灭菌剂灭菌效果显著且稳定，操作简单，成本低，对环境友好。本专利技术采用如下技术方案：一种外植体灭菌试剂的制备方法，将新鲜艾蒿叶片、新鲜芦荟叶片和新鲜洋葱按照质量比(1～5)：(1～5)：(1～5)混合优选1:1:1。粉碎后加入茶树油10～20ml，用蒸馏水定容至500～1000ml，静置浸提12～24h的过滤液，即得灭菌试剂。由于茶树油具有较强的杀菌和渗透力，其较强的渗透力促进了它的杀菌效果。因此，在每1L溶液中加入10～20ml茶树油。该灭菌试剂的最佳组合：新鲜艾蒿叶片20g、新鲜芦荟叶片20g、新鲜洋葱20g，粉碎后加入茶树油20ml，用蒸馏水定容至500ml，静置浸提24h的过滤液。本专利技术同时请求上述灭菌试剂在外植体灭菌处理的应用：在生长季，取植物外植体，清洗擦干后，放入灭菌试剂中浸泡10-30min，取出后用无菌单蒸水冲洗数次，最后用无菌滤纸吸干水分，接种到初代培养基上。进一步的，所述的植物外植体为苹果、蓝莓、月季、迷你蝴蝶兰或广藿香的顶端嫩梢或新鲜花瓣或花蕾或叶片或种子。具体地，上述灭菌试剂可用于生长季苹果、蓝莓、月季、广藿香的嫩梢作为外植体进行灭菌，取上述植物1～3cm长顶端嫩梢，自来水冲洗、擦干后，直接放入到艾蒿、芦荟、洋葱、茶树油混合溶液中浸泡20～30min，取出后用无菌单蒸水冲洗3次，最后用无菌滤纸吸干水分，接种到初代培养基上。或用于生长季苹果、蓝莓、迷你蝴蝶兰、月季、广藿香的新鲜花瓣作为外植体进行灭菌，取上述植物新鲜花瓣自来水冲洗、擦干后，直接放入到艾蒿、芦荟、洋葱、茶树油混合溶液中浸泡10～20min，取出后用无菌单蒸水冲洗3次，最后用无菌滤纸吸干水分，接种到初代培养基上。或用于生长季苹果、季蓝莓、迷你蝴蝶兰、月季、广藿香的花蕾作为外植体进行灭菌。取上述植物花蕾，自来水冲洗、擦干后，直接放入到艾蒿、芦荟、洋葱、茶树油混合溶液中浸泡10～20min，取出后用无菌单蒸水冲洗3次，最后用无菌滤纸吸干水分，取花药接种到初代培养基上。或用于生长季苹果、蓝莓、迷你蝴蝶兰、月季、广藿香的叶片作为外植体进行灭菌。取上述植物叶片，自来水冲洗、擦干后，直接放入到艾蒿、芦荟、洋葱、茶树油混合溶液中浸泡10～30min，取出后用无菌单蒸水冲洗3次，最后用无菌滤纸吸干水分，接种到初代培养基上。还可以用于苹果种子作为外植体进行灭菌。取苹果种子，自来水冲洗、擦干后，直接放入到艾蒿、芦荟、洋葱、茶树油混合溶液中浸泡10～30min，取出后用无菌单蒸水冲洗3次，最后用无菌滤纸吸干水分，接种到初代培养基上。本专利技术采用艾蒿、芦荟、洋葱、茶树油混合溶液取代传统的植物组织培养时外植体灭菌的试剂(如乙醇、次氯酸钠、次氯酸钙、氯化汞等)，实现了外植体灭菌的高效性和稳定性，该灭菌剂对所处理的植物表现温和，对环境无毒、无害、无副作用，是一种环境友好型的植物组织培养外植体灭菌剂。与传统的外植体灭菌剂相比，灭菌成本降低，是传统灭菌剂(如70％乙醇+次氯酸钠)的11.13％。操作更加简单，无需其它前处理。灭菌率较高，可达100％，灭菌效果显著且稳定。本专利技术以生长季的嫩梢、花瓣、花蕾、叶片、种子为外植体，应用上述试剂的杀菌作用，成功地建立起苹果、蓝莓、迷你蝴蝶兰、月季、广藿香等植物组织培养接种前外植体灭菌技术体系，灭菌效果显著且稳定。以实现外植体灭菌试剂对环境的无毒、无害、无副作用，保护生态环境。具体实施方式下面通过具体实施例详述本专利技术，但不限制本专利技术的保护范围。如无特殊说明，本专利技术所采用的实验方法均为常规方法，所用实验器材、材料、试剂等均可从商业途径获得。实施例1在生长季，分别取苹果、蓝莓、月季、广藿香顶端嫩梢，自来水冲洗、擦干后，直接放入到艾蒿、芦荟、洋葱、茶树油混合溶液中浸泡20min，取出后用无菌单蒸水冲洗3次，最后用无菌滤纸吸干水分，接种到初代培养基上。观察、统计嫩梢培养的无菌率。如表1-3所示：以蓝莓嫩梢为例，采用本专利技术灭菌试剂的灭菌效果。以蓝莓嫩梢为例，初代培养基：MS+ZT2.5mg/L+琼脂0.7％+蔗糖30g/L，pH5.8。配方A：新鲜艾蒿叶片10g、新鲜芦荟叶片10g、新鲜洋葱10g，粉碎后加入茶树油10ml，用蒸馏水定容至1000ml，静置浸提12h的过滤液。浸泡外植体20min。配方B：新鲜艾蒿叶片20g、新鲜芦荟叶片5g、新鲜洋葱5g，粉碎后加入茶树油10ml，用蒸馏水定容至500ml，静置浸提24h的过滤液。浸泡外植体20min。配方C：新鲜艾蒿叶片20g、新鲜芦荟叶片20g、新鲜洋葱20g，粉碎后加入茶树油20ml，用蒸馏水定容至500ml，静置浸提24h的过滤液。浸泡外植体30min。配方D：新鲜艾蒿叶片10g、新鲜芦荟叶片30g、新鲜洋葱10g，粉碎后加入茶树油10ml，用蒸馏水定容至1000ml，静置浸提12h的过滤液。浸泡外植体30min。配方E：新鲜艾蒿叶片5g、新鲜芦荟叶片5g、新鲜洋葱20g，粉碎后加入茶树油20ml，用蒸馏水定容至1000ml，静置浸提24h的过滤液。浸泡外植体30min。以上每个配方每瓶接种10个嫩梢，重复5次。计算无菌率。表1外植体灭菌效果(无菌率,％)表2表1结果的方差分析变异来源自由度平方和均方F值F0.05F0.01处理间46104.001526.0063.582.874.43误差20480.0024.00总变异246584.00表3表1结果的差异显著性分析表由上述数据可知，处理3(C)的灭菌效果极显著地好于其他配方。对于嫩梢作为外植体时，最佳的灭菌试剂组合为：新鲜艾蒿叶片20g、新鲜芦荟叶片20g、新鲜洋葱20g，粉碎后加入茶树油20ml，用蒸馏水定容至500ml，静置浸提24h的过滤液。最佳浸泡时间为30min。实施例2在生长季，分别取苹果、蓝莓、月季、广藿香新鲜花瓣，自来水冲洗、擦干后，直接放入到艾蒿、芦荟、洋葱、茶树油混合溶液中浸泡10min，取出后用无菌单蒸水冲洗3次，最后用无菌滤纸吸干水分，接种到初代培养基上。观察、统计花瓣培养的无菌率。如表4-6所示：以月季花瓣为例，采用本专利技术灭菌试剂的灭菌效果。以月季为例，初代培养基：MS+6-BA2.0mg/L+NAA0.2mg/L+琼脂0.7％+蔗糖30g/L，pH5.8。配方A：新鲜艾蒿叶片10g、新鲜芦荟叶片10g、新鲜洋葱10g，粉碎后加入茶树油10ml，用蒸馏水定容至1000本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种外植体灭菌试剂的制备方法，其特征在于，将新鲜艾蒿叶片、新鲜芦荟叶片和新鲜洋葱按照质量比(1～5)：(1～5)：(1～5)混合，粉碎后加入茶树油10～20ml，用蒸馏水定容至500～1000ml，静置浸提12～24h的过滤液，即得灭菌试剂。

【技术特征摘要】
1.一种外植体灭菌试剂的制备方法，其特征在于，将新鲜艾蒿叶片、新鲜芦荟叶片和新鲜洋葱按照质量比(1～5)：(1～5)：(1～5)混合，粉碎后加入茶树油10～20ml，用蒸馏水定容至500～1000ml，静置浸提12～24h的过滤液，即得灭菌试剂。2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在每1L溶液中加入10～20ml茶树油。3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，新鲜艾蒿叶片、新鲜芦荟叶片和新鲜洋葱按照质量比1：1：1混合。4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，该灭菌试剂的最佳组合：新鲜艾蒿...

【专利技术属性】
技术研发人员：侯义龙，庄杰，
申请(专利权)人：大连大学，
类型：发明
国别省市：辽宁,21