一种快速培育YY超雄尼罗罗非鱼的方法技术

本发明专利技术公开了一种快速培育YY超雄尼罗罗非鱼的方法，本发明专利技术利用一对用于检测尼罗罗非鱼遗传性别的引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1～2所示，建立了一种YY超雄尼罗罗非鱼的培育方法，并利用YY超雄尼罗罗非鱼建立了一种快速培育全雄罗非鱼的方法。本发明专利技术首次从尼罗罗非鱼群体筛选天然XY雌鱼，并将其与遗传性别稳定群体的XY雄鱼交配，获得了YY超雄鱼，获得的YY超雄罗非鱼可以用于罗非鱼遗传性别控制，可以快速获得YY超雄罗非鱼。本发明专利技术的方法在天然群体筛选XY雌鱼，适用于罗非鱼遗传性别控制；可用于对不同群体的尼罗罗非鱼性别控制，简化了MAS‑GMT技术操作流程，对推广尼罗罗非鱼性别控制方法具有重要意义。

A Rapid Method for Cultivating YY Super Male Nile Tilapia

【技术实现步骤摘要】
一种快速培育YY超雄尼罗罗非鱼的方法
本专利技术涉及生物技术
，更具体地，涉及一种快速培育YY超雄尼罗罗非鱼的方法。
技术介绍
尼罗罗非鱼属于丽鱼科，具有适应性强，繁殖力高，食性广、杂，抗病力强和肉味鲜美等特点，已成为世界性的主要养殖鱼类。目前尼罗罗非鱼已是我国重要的养殖鱼类，也是我国重要的出口创汇水产品之一，特别是在广东、广西、海南、福建等地，尼罗罗非鱼养殖、加工和贸易产业发达。罗非鱼在我国产量由1990年的10万吨，增长到2012年的155万吨，占世界罗非鱼产量的30.4％。罗非鱼雄鱼比雌鱼生长快50％，雌性尼罗罗非鱼约四个月即达到性成熟，在养殖期能多次繁殖，从而在池塘里产生大量小罗非鱼。而小罗非鱼竞争溶氧、营养物质和空间，并在年终不能长成商品规格，大大影响了罗非鱼养殖的产量和效益，因此，商业性大规模生产全雄鱼是国内外尼罗罗非鱼繁殖的目标。生产全雄鱼可以通过手工挑选，激素诱导，种间杂交等方式，但都有局限性。手工挑选工作量大，准确性差；激素诱导存在食品和生态安全性问题已逐渐被淘汰；种间杂交对于亲本纯度要求高，雄性率一般为90～95％，仍有相当数量的雌鱼。三系配套技术，也称为GeneticallyMaleTilapia(GMT)，是一种先进的罗非鱼全雄鱼苗生产技术，其平均雄性率大于98％。GMT技术大量生产的关键是在建立三系时快速有效地区分正常雄鱼(XY♂)和超雄鱼(YY♂)以及正常雌鱼(XX♀)和雌性转化鱼(XY♀)，虽然各种基因型的鱼在外形上没有差异，需要逐一观察生殖孔，费时费力，近年来，筛选尼罗罗非鱼基因组中与性别决定基因连锁的雌雄性别特异性DNA分子标记，借助Marker-AssistedSelection(MAS)技术就能有效地解决这个问题，MAS使得GMT的商业化生产成为可能。MAS-GMT技术的第一步需诱导XY个体性别逆转即培育雌性转化鱼(XY♀)，需要使用雌激素，仍然不能完全避免激素污染。
技术实现思路
本专利技术的目的是为了克服现有技术的不足，提供一种快速培育YY超雄尼罗罗非鱼的方法。本专利技术的第一个目的是提供一种YY超雄尼罗罗非鱼的培育方法。本专利技术的第二个目的是提供一种快速培育雄罗非鱼的方法。为了实现上述目的，本专利技术是通过以下技术方案予以实现的：现有技术中报导尼罗罗非鱼天然有XY雌鱼的现象，本专利技术通过实验室繁殖验证，即确立尼罗罗非鱼天然XY雌鱼可以用于培育YY超雄鱼，且培育的YY超雄鱼可以用于罗非鱼的遗传性别控制。专利技术人发现来自中国8个地方来源的尼罗罗非鱼群体中，其中7个群体都具有天然的XY雌鱼，专利技术人认为由于受到环境因素的影响，例如温度影响使得XY个体性别逆转。本研究首先从尼罗罗非鱼群体中鉴定天然的XY雌鱼，将其与遗传性别稳定品系的XY雄鱼交配，杂交F1代获得了YY超雄鱼，对YY超雄罗非鱼进行测交验证，获得了高雄(雄性比例大于95％)或全雄后代。因此本专利技术要保护一种YY超雄尼罗罗非鱼的培育方法，筛选天然XY雌鱼，将XY雌鱼与正常XY雄鱼交配，获得YY超雄鱼(图1)。优选地，包括以下步骤：S1.选择存在天然XY雌性尼罗罗非鱼的群体；S2.检测尼罗罗非鱼遗传性别；S3.通过外生殖器的形态判断表型性别，最终筛选出XY雌鱼；S4.将步骤S3筛选出的XY雌鱼和具有稳定遗传性别的尼罗罗非鱼品系的XY雄鱼交配，再检测尼罗罗非鱼遗传性，筛选出子代中的YY超雄鱼；优选地，所述通过外生殖器的形态判断表型性别的具体方法为：用一只手握住鱼，另外一只手轻压鱼体腹部，肛门扩张，生殖孔(也就是肉眼能看清的肛门后的孔)，能随之扩张的是雌鱼，不能扩张的是雄鱼。更优选地，检测尼罗罗非鱼遗传性别使用核苷酸序列如SEQIDNO：1～2所示引物。正向引物F：5′-ATGGCTCCGAGACCTTGACTG-3′(SEQIDNO：1)；反向引物R：5′-CAGAAATGTAGACGCCCAGGTAT-3′(SEQIDNO：2)。更优选地，检测尼罗罗非鱼遗传性别的方法为：提取待测样本基因组DNA，以基因组DNA为模板，利用核苷酸序列如SEQIDNO：1～2所示引物进行PCR扩增，将PCR扩增产进行电泳检测，分析电泳结果，根据测序结果判断尼罗罗非鱼的遗传性别，判断标准为：PCR扩增产物大小为1422bp一条带，则待测样本为XX基因型；PCR扩增产物为两条带，且大小分别为1422和982bp，则待测样本为XY基因型；PCR扩增产物为982bp一条带，则待测样本为YY基因型。更优选地，所述PCR扩增的体系为2×PCRmixBuffer12.5μL，10μmol/L正反向引物各0.5μL，基因组DNA1μL，ddH2O10.5μL，共25μL。更优选地，PCR扩增的程序：95℃10min；95℃30s、60℃30s、72℃90s，37个循环；72℃10min延伸。本专利技术还要求保护一种快速培育雄罗非鱼的方法，将筛选出的YY超雄鱼培育至性成熟后，与尼罗罗非鱼的XX个体繁殖。与现有技术相比，本专利技术具有如下有益效果：本专利技术首次从尼罗罗非鱼群体筛选天然XY雌鱼，并将其与遗传性别稳定群体的XY雄鱼交配，获得了YY超雄鱼，获得的YY超雄罗非鱼可以用于罗非鱼遗传性别控制，可以快速获得YY超雄罗非鱼。本专利技术的方法在天然群体筛选XY雌鱼，适用于实验室或水产养殖企业开展罗非鱼遗传性别控制。本专利技术培育YY超雄罗非鱼的方法可用于对不同群体的尼罗罗非鱼性别控制，简化了MAS-GMT技术操作流程，对推广尼罗罗非鱼性别控制方法具有重要意义。附图说明图1一种新的培养YY超雄罗非鱼的技术路线：通过MAS技术鉴定尼罗罗非鱼天然XY雌鱼和雄鱼，将它们交配，获得YY超雄鱼，可以用于罗非鱼遗传性别控制；MAS：分子标记辅助选育；GMT：遗传雄性罗非鱼。图2为鉴定本专利技术尼罗罗非鱼天然XY雌鱼，日本群体XX、XY和YY个体经过测交验证，XX个体只能扩增一条1422bp的X特异条带，YY个体只能扩增一条982bp的Y特异条带，而XY个体具有X和Y特异的条带，在吴川群体的雌鱼部分只具有X特异的条带，也有部分同时具有X和Y特异条带；M：DNA标记；*：天然XY雌鱼；-：阴性对照。图3为鉴定本专利技术吴川群体雌鱼和日本群体雄鱼杂交亲代、子代遗传性别，吴川群体雌鱼亲本分别为XY(上)和XX(下)型，日本群体雄鱼亲本均为XY型，XY和XY型交配，后代具有XX、XY和YY3种基因型，XX和XY交配，后代只具有XX和XY2种基因型。M：DNA标记。-：阴性对照。图4为鉴定本专利技术培育YY超雄鱼回交和测交亲代、子代遗传性别，YY超雄罗非鱼与母本(XY)回交，后代XY和YY各一半，YY超雄鱼与XX基因型交配，后代全为XY型，M：DNA标记；-：阴性对照。具体实施方式下面结合说明书附图和具体实施例对本专利技术作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本专利技术，并非用于限定本专利技术的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。实施例1一对用于检测尼罗罗非鱼性别基因型的引物设计一对引物(SEQIDNO：1：5′-ATGGCTCCGAGACCTTGACTG-3′和SEQIDNO：2：5′-CAGAAATGTAGACGCCCAGGT本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种YY超雄尼罗罗非鱼的培育方法，其特征在于，筛选天然XY雌鱼，将XY雌鱼与正常XY雄鱼交配，获得YY超雄鱼。

【技术特征摘要】
1.一种YY超雄尼罗罗非鱼的培育方法，其特征在于，筛选天然XY雌鱼，将XY雌鱼与正常XY雄鱼交配，获得YY超雄鱼。2.根据权利要求1所述的培育方法，其特征在于，包括以下步骤：S1.选择存在天然XY雌性尼罗罗非鱼的群体；S2.检测尼罗罗非鱼遗传性别；S3.通过外生殖器的形态判断表型性别，最终筛选出XY雌鱼；S4.将步骤S3筛选出的XY雌鱼和具有稳定遗传性别的尼罗罗非鱼品系的XY雄鱼交配，再检测尼罗罗非鱼遗传性，筛选出子代中的YY超雄鱼。3.根据权利要求2所述的培育方法，其特征在于，检测尼罗罗非鱼遗传性别使用核苷酸序列如SEQIDNO：1～2所示引物。4.根据权利要求3...

【专利技术属性】
技术研发人员：江东能，黄远青，王德寿，孙运侣，李明辉，李广丽，司徒家欣，邝紫颖，谢恩义，石红娟，
申请(专利权)人：广东海洋大学，西南大学，
类型：发明
国别省市：广东,44