本发明专利技术属于食品检测领域，涉及采用HPLC‑MS/MS法定量测定奶粉中AGEs各成分含量的方法，检测条件：色谱条件：C18柱；进样量10μL；流速0.5mL/min；柱温：30℃；流动相A为含有5mM三氟乙酸的高纯水，流动相B为含有5mM三氟乙酸的乙腈，进行梯度洗脱；质谱条件：电喷雾离子源；正离子扫描模式；多反应监测模式；驻留时间500ms；离子源温度：200℃；脱溶剂温度：380℃；脱溶剂气流速：500L/h；锥孔气流速50L/h；进样锥电压20V；毛细管电压：3kV；脱溶剂气和锥孔气为氮气，碰撞气体为氩气。本方法操作简便、快速、准确度高、灵敏度好。
A method for quantitative determination of AGEs in milk powder by HPLC-MS/MS
【技术实现步骤摘要】
一种采用HPLC-MS/MS法定量测定奶粉中AGEs各成分含量的方法
:本专利技术属于食品检测领域，具体涉及采用HPLC-MS/MS法定量测定奶粉中AGEs各成分含量的方法
技术介绍
:食品加工与贮藏过程中发生的一些化学变化，在改变食品组分的结构和功能的同时也会产生一些不可忽视的有害物质，即晚期糖基化终产物(AGEs)，这是通过美拉德反应、脂肪氧化反应或多元醇降解形成的一类稳定的产物，可见多种食品中如乳制品，油炸食品油条、麻花，洋快餐中的炸薯条、炸面包以及零食里的炸薯片、油炸饼干等。AGEs的形成与食品的原料、加工工艺、加工温度、加工时间以及贮藏条件均有密切关系。膳食AGEs大量摄入含有的食品产生致糖尿病和肾脏毒性损害的作用的，导致轻度炎症、增加氧化应激、诱发动脉粥样硬化，有关这方面的研究成为了国际上的研究热点之一。研究发现加热处理的食品中AGEs含量是未加工的食品的10～100倍，CML含量可增加高达200倍。因此CML常被看做是检测食品中含量的主要目标产物。目前，我国对食品中AGEs尚未建立相关的检测标准。由于食品样难处理和种类繁多，结构复杂等原因，对于食品中的检测缺乏通用有效的方法，且无法确定哪些指标为潜在危害因子。目前国内外测定的方法分为仪器法和免疫化学法，前者主要有荧光光谱法和色谱分析法，后者主要是酶联免疫法。现有的检测方法对样品处理要求高，耗时长且能够测定的成分有限，不能准确检测食品中AGEs全部成分，进而对食品中AGEs做出全面准确的分析。目前，缺乏快速鉴别食品中AGEs的质量控制方法。如何鉴别食品中具有潜在危害作用的AGEs成分以及对这些成分的质量控制，目前未有有效的研究方法和技术手段。本研究的目的和意义在于首次采用“细胞膜固相色谱技术”筛选出与细胞结合的“特异性成分”的研究思路，进一步分析食品中这些特异性的成分，建立其快速鉴别检测方法，能有效的实施食品中具有潜在危害作用的AGEs成分快速检出，实现对食品直观有效的质量控制。本项目以“含非酶糖基化产物食品”为研究对象，构建细胞膜固相色谱筛选体系，借助HPLC-DAD、LC-MS/MS等技术分别在“含非酶糖基化产物食品”中筛查其相应特异性成分，并建立快速检测此类特异性化学成分的快速分析方法。本项目将为“含非酶糖基化产物食品”的快速鉴别分析提供重要技术储备。
技术实现思路
:本专利技术的目的是提供一种一种采用HPLC-MS/MS法定量测定奶粉中AGEs各成分含量的方法。本专利技术的目的是通过以下方式实现的：一种采用HPLC-MS/MS法定量测定奶粉中AGEs各成分含量的方法，检测条件如下：(1)色谱条件：AgilentZORBAXSBC18液相色谱柱；进样量5～20μL；流速为0.2～1.0mL/min；柱温：25～35℃；流动相A为含有5mM三氟乙酸的高纯水，流动相B为含有5mM三氟乙酸的乙腈，进行梯度洗脱；(2)质谱条件：电喷雾离子源(ESI)；正离子扫描模式；多反应监测模式(MRM)；驻留时间400～600ms；离子源温度：180～220℃；脱溶剂温度：360～400℃；脱溶剂气流速：400～600L/h；锥孔气流速40～60L/h；进样锥电压15～25V；毛细管电压：2～4kV；脱溶剂气和锥孔气为氮气，碰撞气体为氩气。所述的采用HPLC-MS/MS法定量测定奶粉中AGEs各成分含量的方法，优选的检测条件如下：(1)色谱条件：AgilentZORBAXSBC18液相色谱柱；进样量10μL；流速为0.5mL/min；柱温：30℃；流动相A为含有5mM三氟乙酸的高纯水，流动相B为含有5mM三氟乙酸的乙腈，进行梯度洗脱；(2)质谱条件：电喷雾离子源(ESI)；正离子扫描模式；多反应监测模式(MRM)；驻留时间500ms；离子源温度：200℃；脱溶剂温度：380℃；脱溶剂气流速：500L/h；锥孔气流速50L/h；进样锥电压20V；毛细管电压：3kV；脱溶剂气和锥孔气为氮气，碰撞气体为氩气。所述的采用HPLC-MS/MS法定量测定奶粉中AGEs各成分含量的方法，色谱条件中的梯度洗脱，优选的洗脱参数如下：0至3min，流动相A从95％线性下降至88％，流动相B由5％线性上升至12％；4至12min，流动相A保持在88％，流动相B保持在12％；13至25min，流动相A从88％线性下降至55％，流动相B由12％线性上升至45％；13至25min，流动相A从88％线性下降至55％，流动相B由12％线性上升至45％。具体实施方式：通过细胞膜固相体系筛查出奶粉中主要含有羧甲基赖氨酸(CML)、羧乙基赖氨酸(CEL)和吡咯素(Pyr)三种AGEs成分。本节采用HPLC-MS/MS分析法，电喷雾离子源多反应监测(MRM)模式，通过方法学论证，以期构建同步测定奶粉中CML、CEL和Pyr的定量分析方法，为奶粉中AGEs的监测和控制提供基础。1实验材料与仪器(1)试剂与材料：正己烷(国药集团化学试剂有限公司，批号：20160712)；乙醇(南京化学试剂股份有限公司)；双圈定性滤纸(通用电器生物科技杭州有限公司)；氢氧化钠(南京化学试剂股份有限公司，批号：170608244E)；盐酸(上海凌峰化学试剂有限公司，批号：20160319)；十水合四硼酸钠(国药集团化学试剂有限公司，批号：20170615)；硼氢化钠(国药集团化学试剂有限公司，批号：20170315)；氨水(南京化学试剂股份有限公司，批号：170401070J)；Strata-X-C固相萃取柱(phenomenex公司，批号：S17-001242)；实验室用水为Milli-Q超纯水；CML标准品(加拿大TRC公司，纯度98％，CAS号5746-04-3)、CEL标准品(加拿大TRC公司，纯度96％，CAS号5746-03-2)、Pyr标准品(加拿大TRC公司，纯度98％，CAS号74509-14-1)。(2)仪器：Agilent6495LC/MS/MS液相色谱质谱联用仪、AgilentZORBAXSBC18(150mm×2.1mm，3.5um)液相色谱柱美国安捷伦公司；XB-80A涡旋振荡器(海门其林贝尔有限公司)；Milli-Q纯水机(美国Millipore公司)；高速冷冻离心机(美国Beckman公司)；AnkeTDL-40B型低速大容量多管离心机(上海安亭科学仪器厂)；MettlerAL204十万分之一天平梅特勒-托利多仪器有限公司；AL204电子天平(美国梅特勒-托利多)2对照品溶液的制备分别准确称取适量CML、CEL和Pyr标准品，用超纯水溶解配成CML、CEL和Pyr浓度约为1mg/mL的标准储备溶液，置于4℃冰箱中保存；移取适量CML、CEL和Pyr标准溶液，分别配制质量浓度为10，50，100，200，400和800ng/mL的CML、CEL和Pyr混合标准溶液。3样品处理3.1奶粉中游离态AGEs检测样品前处理称取1g研磨粉碎后的样品置于50mL离心管中，加入10ml正己烷，充分涡旋1min，4000r/min离心10min，弃去正己烷层，重复上述正己烷脱脂过程3次，氮吹(40℃)完全挥去正己烷。加入10mL超纯水，充分涡旋1min，然后10000r/min离心10min沉淀杂质，然后本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种采用HPLC‑MS/MS法定量测定奶粉中AGEs各成分含量的方法，其特征在于，检测条件如下：(1)色谱条件：Agilent ZORBAX SB C18液相色谱柱；进样量5～20μL；流速为0.2～1.0mL/min；柱温：25～35℃；流动相A为含有5mM三氟乙酸的高纯水，流动相B为含有5mM三氟乙酸的乙腈，进行梯度洗脱；(2)质谱条件：电喷雾离子源(ESI)；正离子扫描模式；多反应监测模式(MRM)；驻留时间400～600ms；离子源温度：180～220℃；脱溶剂温度：360～400℃；脱溶剂气流速：400～600L/h；锥孔气流速40～60L/h；进样锥电压15～25V；毛细管电压：2～4kV；脱溶剂气和锥孔气为氮气，碰撞气体为氩气。
【技术特征摘要】
1.一种采用HPLC-MS/MS法定量测定奶粉中AGEs各成分含量的方法，其特征在于，检测条件如下：(1)色谱条件：AgilentZORBAXSBC18液相色谱柱；进样量5～20μL；流速为0.2～1.0mL/min；柱温：25～35℃；流动相A为含有5mM三氟乙酸的高纯水，流动相B为含有5mM三氟乙酸的乙腈，进行梯度洗脱；(2)质谱条件：电喷雾离子源(ESI)；正离子扫描模式；多反应监测模式(MRM)；驻留时间400～600ms；离子源温度：180～220℃；脱溶剂温度：360～400℃；脱溶剂气流速：400～600L/h；锥孔气流速40～60L/h；进样锥电压15～25V；毛细管电压：2～4kV；脱溶剂气和锥孔气为氮气，碰撞气体为氩气。2.根据权利要求1所述的采用HPLC-MS/MS法定量测定奶粉中AGEs各成分含量的方法，其特征在于，检测条件如下：(1)色谱条件：AgilentZORBAXSBC18液相色谱柱；进样量10μL；流速为...
【专利技术属性】
技术研发人员：朱毛毛，胡飞杰，顾慧丹，楼超群，王晓丽，
申请(专利权)人：南京市产品质量监督检验院，
类型：发明
国别省市：江苏,32
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