叶酸靶向载NaHCO3脂质体及其在增强肿瘤免疫治疗效果方面的应用制造技术

本发明专利技术公开了一种叶酸靶向载NaHCO3脂质体及其在增强肿瘤免疫治疗效果方面的应用。本发明专利技术制备了一种以脂质体薄膜为外壳包载NaHCO3形成的纳米级包载NaHCO3脂质体，该载NaHCO3脂质体能够靶向吸附于肿瘤细胞，促进脂质体被肿瘤细胞吞噬，该载NaHCO3脂质体能够引起肿瘤细胞碎片增加，促进肿瘤抗原释放，还能够杀伤肿瘤细胞。同时，该载NaHCO3脂质体联合PD‑1抗体在体内对肿瘤具有抑制作用，能够激活体内抗肿瘤免疫，肿瘤组织内CD4+T细胞明显升高，能够增强PD‑1抗体的抗肿瘤效果，具有很好的应用前景。

Folic acid-targeted NaHCO3 liposomes and their application in enhancing the immunotherapeutic effect of tumors

【技术实现步骤摘要】
叶酸靶向载NaHCO3脂质体及其在增强肿瘤免疫治疗效果方面的应用
本专利技术属于生物医药
更具体地，涉及一种叶酸靶向载NaHCO3脂质体及其在辅助肿瘤免疫治疗方面的应用，特别是辅助PD-1抗体治疗肝癌、乳腺癌和结肠癌等肿瘤的新用途。
技术介绍
肿瘤是一种严重威胁人类健康的疾病，在中国肿瘤死亡率逐年上升，已成为我国死亡率最高的疾病。目前，以程序性死亡分子1(programmeddeathprotein1,PD-1)抗体为代表的免疫治疗药物为多种恶性肿瘤的治疗提供了新途径，临床研究表明，PD-1抗体对黑色素瘤，肺癌，乳腺癌和肝癌等肿瘤都显示出了较好的治疗效果。然而，仍有超过半数患者无法从PD-1抗体治疗中持续获益。研究表明，肿瘤抗原暴露不足、T细胞在肿瘤中的聚集少，可能是PD-1抗体在一些患者中疗效不佳的原因。空化效应(cavitation)是指存在于液体中的被脂质、蛋白或高分子聚合物包裹的微泡空化核在声波的作用下振动，当声压达到一定值时发生的生长和崩溃的动力学过程，分为稳定空化(stablecavitation)及惯性空化(inertialcavitation)。稳定空化是指微泡空化核在极低强度的声波中，随着声波的频率变大变小的过程；而惯性空化是指一定强度的声波的辐照下，振荡振幅在低压阶段时，微泡可以快速涨大，直到周围流体的惯性将微泡撕裂，成为碎片或多个更小的气泡，引起一系列较为强烈的机械生物效应及机械震荡波。有文献报道，这些机械效应可起到类似消融的作用，且破坏细胞后所产生的细胞碎片抗原性较热消融强。这些坏死的细胞及碎片可成为具有高抗原性的肿瘤抗原，通过抗原递呈细胞(antigen-presentingcell,APC)识别，引起强烈的抗肿瘤适应性免疫。许多学者将纳米材料联合空化效应及声孔效应爆破肿瘤新生血管壁，向肿瘤组织输送抗肿瘤药物及基因来达到治疗肿瘤的目的。然而此类微泡粒径较大，无法穿过肿瘤血管间隙，只能在肿瘤血管内爆破，所产生空化效应对肿瘤细胞的损伤有限，无法达到破坏细胞并产生高抗原碎片的目的。另外，肿瘤细胞中的溶酶体内具有较强的酸性环境，晚期内涵体的pH值一般在5.0左右。有研究制备以脂质体为外壳，NH4HCO3为核心的产气聚合物纳米颗粒，进入肿瘤细胞并经内吞作用进入溶酶体的酸性环境后，其内部包裹的NH4HCO3会发生相变，快速产生大量气体。CO2的瞬间产生、增多和爆破会产生巨大的剪切力和冲击波，产生瞬时空化的效应。这种效应作用于溶酶体上，能够机械性地破坏溶酶体膜，将溶酶体内的水解酶释放出来，从而引起细胞凋亡和坏死，达到杀灭肿瘤细胞的目的。然而，该方案需要在加热的条件下发挥作用，同时该研究也没有涉及其是否对PD-1抗体免疫疗效的影响。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是克服上述现有技术的缺陷和不足，制备了一种叶酸靶向载NaHCO3脂质体，可特异性吸附于肿瘤细胞，促进肿瘤细胞内吞，机械性地破坏溶酶体膜，促进肿瘤抗原暴露，具有增强免疫治疗的效果。本专利技术的目的是提供一种叶酸靶向载NaHCO3脂质体及其制备方法。本专利技术另一目的是提供所述载NaHCO3脂质体在制备具有促进肿瘤细胞抗原暴露/释放作用的药物以及具有杀伤肿瘤细胞作用的药物中的应用。本专利技术再一目的是提供所述载NaHCO3脂质体和PD-1抗体联用在制备抗肿瘤药物方面的应用。本专利技术上述目的通过以下技术方案实现：一种叶酸靶向载NaHCO3脂质体，是以脂质体薄膜为外壳包载NaHCO3形成纳米级包载NaHCO3脂质体。具体是以改性磷脂酰乙醇胺(DPPE或DSPE)、磷脂酰胆碱(PC)、DPSE-PEG2000和DSPE-PEG2000-FA为原料反应制成脂质体薄膜，然后包载NaHCO3制备得到(优选可采用薄膜水化法和超声破碎法制备)。其中，所得到的载NaHCO3脂质体为纳米级包载NaHCO3脂质体。优选地，所述纳米级包载NaHCO3脂质体的粒径为150～250nm。更优选地，所述纳米级包载NaHCO3脂质体的粒径为200nm。优选地，改性磷脂酰乙醇胺、磷脂酰胆碱、DPSE-PEG2000和DSPE-PEG2000-FA的摩尔比例为8～12：25～35：2～3：2～3。更优选地，改性磷脂酰乙醇胺、磷脂酰胆碱、DPSE-PEG2000和DSPE-PEG2000-FA的摩尔比例为10：30：2.5：2.5。更优选地，所述磷脂酰胆碱为DSPC或DPPC。为更好地控制脂质体的粒径及NaHCO3的包载效率，优选地，所述DPPE、DSPC、DPSE-PEG2000和DSPE-PEG2000-FA的摩尔比例为8～12：25～35：2～3：2～3。更优选地，所述DPPE、DSPC、DPSE-PEG2000和DSPE-PEG2000-FA的摩尔比例为10：30：2.5：2.5。具体优选地，所述载NaHCO3脂质体的制备方法包括如下步骤：S1.将DPPE、DSPC、DPSE-PEG2000和DSPE-PEG2000-FA加入反应容器，逐滴加入溶剂直至完全溶解，真空旋蒸挥发溶剂，在反应容器内壁形成一层透明的均质脂质体薄膜；S2.向反应容器内加入0.4～0.8MNaHCO3，在室温下水化，至薄膜完全漂浮或溶解于NaHCO3中；S3.水化后的液体冰浴，超声破碎至液体澄清透亮，得到纳米级包载NaHCO3脂质体。其中，优选地，步骤S1所述溶剂为氯仿、氯仿甲醇溶液(氯仿：甲醇＝9：1)或二氯甲烷乙醇溶液(二氯甲烷：乙醇＝1：2)。优选地，步骤S2的NaHCO3浓度为0.6M。本专利技术上述制备的纳米级脂质体成功包载NaHCO3，可在肿瘤区域内特异性聚集，对肿瘤细胞具有抗原暴露能力和空化杀伤效能。静脉注射该载NaHCO3脂质体，并于其后注射PD-1抗体，共治疗4次。可显著增强PD-1抗体的抗肿瘤疗效。因此，以下应用也均应在本专利技术的保护范围之内：载NaHCO3脂质体在制备具有促进肿瘤细胞抗原暴露/释放作用的药物中的应用。载NaHCO3脂质体在制备具有杀伤肿瘤细胞作用的药物中的应用。具体是载NaHCO3脂质体可破坏肿瘤细胞，引起肿瘤细胞碎片增加；引起肿瘤细胞坏死，导致PI阳性肿瘤细胞增加。载NaHCO3脂质体在制备增强PD-1抗体抗肿瘤疗效的增效药物中的应用。载NaHCO3脂质体和PD-1抗体联用在制备抗肿瘤药物方面的应用。优选地，所述肿瘤为肝癌、结肠癌或乳腺癌。更优选地，所述乳腺癌为三阴性乳腺癌。本专利技术具有以下有益效果：本专利技术制备了一种叶酸靶向载NaHCO3脂质体，该载NaHCO3脂质体能够靶向吸附于肿瘤细胞，促进脂质体被肿瘤细胞吞噬，该载NaHCO3脂质体能够促进肿瘤抗原释放，还能够杀伤肿瘤细胞，破坏肿瘤细胞，引起肿瘤细胞碎片增加；引起肿瘤细胞坏死，导致PI阳性肿瘤细胞增加。同时，该载NaHCO3脂质体联合PD-1抗体在体内对肿瘤具有抑制作用，能够激活体内抗肿瘤免疫，肿瘤组织内CD4+T细胞明显升高，能够增强PD-1抗体的抗肿瘤疗效，具有很好的应用前景。附图说明图1为叶酸靶向载NaHCO3脂质体的电镜图。图2为叶酸靶向载NaHCO3脂质体的XDR衍射图谱(A)和产气能力(B)。图3为叶酸靶向载NaHCO3脂质体的肿瘤靶向能力。图4中图A、B、C分别说明叶酸靶向载NaHCO3脂本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种叶酸靶向载NaHCO3脂质体，其特征在于，以改性磷脂酰乙醇胺、磷脂酰胆碱、DPSE‑PEG2000和DSPE‑PEG2000‑FA为原料反应制成脂质体薄膜，然后包载NaHCO3制备得到载NaHCO3脂质体；其中，所述改性磷脂酰乙醇胺为DPPE或DSPE。

【技术特征摘要】
1.一种叶酸靶向载NaHCO3脂质体，其特征在于，以改性磷脂酰乙醇胺、磷脂酰胆碱、DPSE-PEG2000和DSPE-PEG2000-FA为原料反应制成脂质体薄膜，然后包载NaHCO3制备得到载NaHCO3脂质体；其中，所述改性磷脂酰乙醇胺为DPPE或DSPE。2.根据权利要求1所述载NaHCO3脂质体，其特征在于，所述改性磷脂酰乙醇胺、磷脂酰胆碱、DPSE-PEG2000和DSPE-PEG2000-FA的摩尔比例为8～12：25～35：2～3：2～3。3.根据权利要求1所述载NaHCO3脂质体，其特征在于，采用薄膜水化法和超声破碎法制备得到载NaHCO3脂质体。4.根据权利要求1～3任一所述载NaHCO3脂质体，其特征在于，其制备方法包括如下步骤：S1.将改性磷脂酰乙醇胺、磷脂酰胆碱、DPSE-...

【专利技术属性】
技术研发人员：罗葆明，周泊阳，刘晓迪，江琼超，
申请(专利权)人：中山大学孙逸仙纪念医院，
类型：发明
国别省市：广东,44