一种同位素稀释质谱法测定血清miR-224含量的方法技术

技术编号:22073598 阅读:38 留言:0更新日期:2019-09-12 13:28
本发明专利技术公开了一种同位素稀释质谱法测定血清miR‑224含量的方法,包括如下步骤:(1)合成miR‑224核酸单链并配成溶液,建立标准曲线;(2)合成核酸肽探针并配成溶液,用以捕获miR‑224;(3)合成同位素标记的多肽并配成溶液作为内标;(4)在血清样本中提取miRNA;(5)将提取出的miRNA生物素化;(6)将上述miRNA与链霉素琼脂糖球反应,形成miRNA‑生物素‑链霉亲和素琼脂糖球复合物;(7)加入核酸肽探针捕获miR‑224‑生物素‑链霉亲和素琼脂糖球复合物;(8)将上述复合物清洗干净后加入胰蛋白酶酶解,然后将酶解产物固相萃取,将萃取出的多肽吹干并复溶;(9)将复溶后的多肽和同位素标记的多肽样品进行质谱分析;(10)计算血清样本中miR‑224含量。本发明专利技术准确度高,结果可靠。

An Isotope Dilution Mass Spectrometry Method for the Determination of Serum Mi-224 Content

【技术实现步骤摘要】
一种同位素稀释质谱法测定血清miR-224含量的方法
本专利技术涉及一种测定血清miR-224含量的方法,尤其涉及一种同位素稀释质谱法测定miR-224含量的方法。
技术介绍
研究表明,miR-224是肿瘤相关的一个miRNA分子,在多种恶性肿瘤组织(如胃癌、胰腺癌、肝癌、结直肠癌)中呈现高表达。目前,miR-224的定量检测方法分间接法和直接法,其中间接法包括聚合酶链反应法、荧光共振能量转移法、基因芯片法、电化学催化法、下一代测序法、电化学法等。直接法包括双重特异性核酸酶辅助光谱检测法、微分干涉对比显微镜成像法、毛细管电泳法等。间接法通常需要首先对miR-224进行扩增或用化学试剂和酶进行修饰,然后进行凝胶成像或荧光素标记,需要耗费大量的时间和人力成本,而且结果易受各种因素的影响。上述miR-224直接法虽然一定程度上解决了间接法缺陷,但定量结果准确性较差。同位素稀释质谱法是一种新的miR-224直接定量检测法,是目前公认的化合物准确定量的权威方法。该法利用质谱测定加入了同位素标记的待测物样品中标记与非标记待测物峰面积或峰高比值来推算待测物在样品中浓度。该法特异性高、灵敏度高、定量本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种同位素稀释质谱法测定miR‑224含量的方法,包括如下步骤:(1)将合成的miR‑224核酸单链配成溶液,用于建立标准曲线;(2)合成核酸肽探针配成溶液,用以捕获miR‑224;(3)将合成的同位素标记多肽并配成溶液作为内标;(4)在血清样本中提取miRNA;(5)将提取出来的miRNA进行生物素化;(6)将上述生物素化的miRNA‑224与链霉素琼脂糖球反应,形成miRNA‑224‑生物素‑链霉亲和素琼脂糖球复合物;(7)加入核酸肽探针捕获miR‑224‑生物素‑链霉亲和素琼脂糖球复合物;(8)将核酸肽探针‑miR‑224‑生物素‑链霉亲和素琼脂糖球复合物清洗干净后加入胰蛋白酶进行酶...

【技术特征摘要】
1.一种同位素稀释质谱法测定miR-224含量的方法,包括如下步骤:(1)将合成的miR-224核酸单链配成溶液,用于建立标准曲线;(2)合成核酸肽探针配成溶液,用以捕获miR-224;(3)将合成的同位素标记多肽并配成溶液作为内标;(4)在血清样本中提取miRNA;(5)将提取出来的miRNA进行生物素化;(6)将上述生物素化的miRNA-224与链霉素琼脂糖球反应,形成miRNA-224-生物素-链霉亲和素琼脂糖球复合物;(7)加入核酸肽探针捕获miR-224-生物素-链霉亲和素琼脂糖球复合物;(8)将核酸肽探针-miR-224-生物素-链霉亲和素琼脂糖球复合物清洗干净后加入胰蛋白酶进行酶解,然后将酶解产物进行固相萃取,将萃取出的多肽吹干并复溶;(9)将复溶后的多肽和同位素标记的多肽样品进行质谱分析;(10)计算血清样品中miR-224含量。2.根据权利要求书1所述的同位素稀释质谱法测定miR-224含量的方法,其特征在于,所述步骤(1)具体包括如下步骤:miR-224核酸单链合成量为4OD值,每管1OD值分装,在每管中准确加入250μLDEPC水,配制成浓度为20μmol/L的miR-224溶液并分装至1.5mL离心管中,每管分装50μL,然后在各管中加入950μL超纯水稀释至浓度为1μmol/L作为贮存液并分装至1.5mL离心管中,每管分装20μL,并将分装好的核酸肽探针溶液置于-70℃冰箱保存;使用前,在miR-224贮存液中加入DEPC水稀释成系列浓度用于建立标准曲线。3.根据权利要求书1所述的同位素稀释质谱法测定miR-224含量的方法,其特征在于,所述步骤(2)具体包括如下步骤:核酸肽探针序列为5’-CTAAACGGAACCACTAGTGACTTGA-3’-PEG2-GDRALFVGEPNR,其中5’-CTAAACGGAACCACTAGTGACTTGA-3’为探针核酸部分,与miR-224序列5’-UCAAGUCACUAGUGGUUCCGUUUAG-3’互补配对;GDRALFVGEPNR为探针肽部分,其特征是非人类任何蛋白胰酶水解后的特异性肽段,包含胰酶水解位点精氨酸R;PEG2连接核酸与肽;核酸肽探针合成量为20nmol,准确加入1mL超纯水,配制成浓度为20μmol/L的核酸肽探针溶液,每管分装100μL,然后在各管中加入900μL超纯水稀释至浓度为2μmol/L作为贮存液并分装至1.5mL离心管中,每管分装50μL,并将分装好的核酸肽探针溶液置于-70℃冰箱保存;使用前,在核酸肽探针贮存液中加入1950μL超纯水稀释至0.05μmol/L,得到核酸肽探针工作液,现用现配。4.根据权利要求书1所述的同位素稀释质谱法测定miR-224含量的方法,其特征在于,所述步骤(3)具体包括如下步骤:将合成的1mg同位素标记的多肽GDRA[13C615N]LFVGEPNR首先用300μL乙腈超声溶解,然后加入700μL超纯水配制成浓度约为1mg/mL的同位素标记多肽贮存液并分装至1.5mL离心管中,每管分装100μL,然后在各管中加入900μL超纯水稀释至约为0.1mg/mL并分装至并1.5mL离心管中,每管分装10μL,并将分装好的核酸肽探针溶液置于-70℃冰箱保存;使用前,在浓度约为0.1mg/mL的同位素标记多肽溶液中加入990μL超纯水稀释至约为1mg/L,得到作为内标的同位素标记多肽工作液,现用现配,在定量中作为内标。5.根据权利要求书1所述的同位素稀释质谱法测定miR-224含量的方法,其特征在于,所述步骤(4)为使用miRNA快速提取试剂盒提取血清样本中miR-224,具体包括如下步骤:①用加样枪吸取0.25mL血清并加入0.75mL裂解液MRL,用加样枪吹打液体样品几次以帮助裂解样品中残余细胞;②将上述样品剧烈震荡混匀,并在15-30℃条件下孵育5分钟以使核蛋白体完全分解;③加入0.15mL氯仿,盖紧样品管盖,剧烈振荡15秒并将其在室温下孵育3分钟;④于4℃12,000rpm离心10分钟,样品会分成三层:下层有机相,中间层和上层无色的水相,RNA存在于水相中;水相层的容量大约为所加MRL体积的60%,把水相转移到新管中,进行下一步操作;⑤加入0.6倍体积70%乙醇,颠倒混匀,并将得到的溶液和可能沉淀一起转入吸附柱RA中,其中,吸附柱套在收集管内;⑥10,000rpm离心45秒,收集下滤液,准确估计下滤液的体积,加入2/3倍体积的无水乙醇,颠倒几次混匀,将混合液倒入到吸附柱RB中,10,000rpm离心30秒弃掉废液;⑦加入700μL漂洗液RW,12,000rpm离心60秒,弃掉废液;⑧加入500μL漂洗液RW,12,000rpm离心60秒,弃掉废液;⑨将吸附柱RB放回空收集管中,12,000rpm离心2分钟,尽量除去漂洗液,以免漂洗液中残留乙醇抑制下游反应;⑩取出吸附柱RB,放入一个RNasefree离心管中,根据预期RNA产量在吸附膜的中间部位加30-80μLRNasefreewater,室温放置2分钟,12,000rpm离心1分钟,收集得到纯净miRNA保存于-20℃或者更低备用。6.根据权利要求书1所述的同位素稀释质谱法测定miR-224含量的方法,其特征在于,所述步骤(5)为使用PierceTMRNA3’EndBiotinylationKit试剂盒对血清样品中提取出的miR-224进行生物素化,具体包括如下步骤:①除30%PEG和DMSO外,在冰上溶解试剂盒中其他所有成分,室温溶解DMSO,将30%PEG在37℃孵育5-10...

【专利技术属性】
技术研发人员:王峰季伙燕吴安琪李袆鞠少卿王建新沈蕾
申请(专利权)人:南通大学附属医院
类型:发明
国别省市:江苏,32

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