抗MSH2蛋白单克隆抗体、细胞系及其制备方法和应用技术

技术编号:22068466 阅读:53 留言:0更新日期:2019-09-12 11:58
本发明专利技术涉及生物检测领域,提供了一种抗MSH2蛋白单克隆抗体,其重链和轻链可变区的氨基酸序列分别是SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列。发明专利技术人还提供了抗MSH2蛋白单克隆抗体的制备方法,选取人MSH2氨基酸第411‑424位蛋白并与KLH偶联,作为免疫原。发明专利技术人还提供了一株分泌抗MSH2蛋白的杂交瘤细胞系,所述细胞系为小鼠杂交瘤细胞系1B11‑14‑16,保藏号为:CGMCC NO.17405。抗MSH2蛋白单克隆抗体,具有高特异性、敏感性,可以特异性识别表达MSH2蛋白的细胞,适用于免疫学检测,特别是免疫组化检测。

Monoclonal Antibodies Against MSH2 Protein, Cell Lines and Their Preparation and Application

【技术实现步骤摘要】
抗MSH2蛋白单克隆抗体、细胞系及其制备方法和应用
本专利技术涉及生物检测领域,特别涉及抗MSH2蛋白单克隆抗体、细胞系及其制备方法和应用。
技术介绍
DNA错配修复系统(MMR)是由特异修复DNA碱基错配的酶分子组成。研究显示,MMR基因的突变和(或)功能缺失与多种肿瘤的发生相关,如结直肠癌、皮肤癌、卵巢癌、子宫内膜癌等。MSH2(MutShomolog2)基因是最早发现、也是学者们研究MMR基因时聚焦的焦点之一,是MMR系统中的“管家基因”,其具有识别错配的功能,长3111bp的cDNA含有2802bp的开放阅读框,编码的蛋白中含有934个氨基酸。MSH6是错配修复家族的重要成员之一,DNA全长23806bp,cDNA长4200bp,主要作用是纠正碱基错配以及小片段插入和缺失。当DNA发生错配时,MSH6蛋白与MSH2蛋白结合生成能对错配位点进行识别的MutS-α异二聚体,该二聚体与错配位点结合后启动错配修复过程,从而保证微卫星稳定性,将细胞内基因的自发突变率控制在较低水平,使基因组遗传的稳定性和真实性得到保障。MSH2蛋白几乎出现于所有结肠正常粘膜,阳性率达94%。阳性产物定位于核内,部分细胞同时出现胞浆染色。阳性细胞分布于粘膜全层,以腺窝下1/3-2/3中排列更为密集。杯装细胞中偶见MSH2蛋白的表达。MSH2蛋白也表达在间质纤维母细胞、血管内皮细胞以及淋巴细胞上,呈核型或核浆型,但浆细胞内表达较少。MSH2基因的突变与微卫星不稳定性和一些癌症有关,研究发现MSH2基因蛋白阳性表达率从正常组织、腺瘤不典型增生、腺瘤癌变到腺癌逐渐降低,提示在腺瘤阶段已经有MMR的基因的突变或功能异常,并随其恶性程度的增加,MMR基因的突变频率也逐渐升高。表明MMR基因的突变,尤其是MSH2的突变可能是结直肠癌发生的早期事件之一。其中遗传性非息肉病性结直肠癌(HNPCC)一种特殊类型的结直肠癌。遗传性非息肉病性结直肠癌(HNPCC),有时称为Lynch综合征,以常染色体显性遗传方式遗传,其中仅突变错配修复基因的一个拷贝的遗传就足以引起疾病表型,约占结直肠癌总数的15%~18%,占家族性结直肠癌的50%。MSH2基因的突变占该疾病相关基因改变的40%,与HNPCC相关的突变广泛分布在MSH2的所有结构域中,并且是MLH1突变的主要原因。另外MSH2和其他错配修复基因的突变也会导致DNA损伤未修复,导致突变频率增加。
技术实现思路
专利技术人提供了一种抗MSH2蛋白单克隆抗体,所述单克隆抗体重链和轻链可变区的氨基酸序列分别是SEQIDNO.2和SEQIDNO.3所示的氨基酸序列。进一步地,所述单克隆抗体重链和轻链可变区氨基酸序列分别是SEQIDNO.4和SEQIDNO.5所示的核苷酸序列所编码。进一步地,所述单克隆抗体特异性识别MSH2蛋白。进一步地,所述单克隆抗体特异性识别中SEQIDNO.1所示的氨基酸序列。进一步地,所述单克隆抗体由保藏号为CGMCCNO.17405的杂交瘤细胞系产生。所述细胞株为小鼠杂交瘤细胞系1B11-14-16,分类命名为:小鼠杂交瘤细胞系,该细胞系已于2019年03月21日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏,地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。进一步地,所述抗MSH2蛋白为小鼠IgG2b亚型单克隆抗体。专利技术人还提供了一种抗MSH2蛋白单克隆抗体的制备方法,选取MSH2蛋白氨基酸序列第919位至第934位氨基酸在其N端添加巯基修饰并与载体蛋白KLH进行偶联作为免疫原。专利技术人还提供了一株分泌抗MSH2蛋白的杂交瘤细胞系,所述细胞株为小鼠杂交瘤细胞系1B11-14-16,所述细胞系保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏号为:CGMCCNO.17405。专利技术人还提供上述任一所述的抗MSH2蛋白单克隆抗体,在MSH2蛋白免疫检测中的用途。进一步地,所述免疫检测包括免疫组织化学法,免疫印迹法和酶联免疫法。区别于现有技术,上述技术方案依据MSH2蛋白与DNA结合的结构、抗原性、组成氨基酸的亲疏水性以及二级结构,选择具有区别于其他类似蛋白、长度适宜且具有特殊抗原性的氨基酸序列第919-934位蛋白(SEQIDNo.1),区域作为抗原肽。在N端添加巯基修饰并偶联KLH,作为免疫源C(KLH-NSFVNEIISRIKVTT-Cys)。对小鼠进行免疫,经细胞融合、筛选和亚克隆,获得高效分泌抗MSH2蛋白单克隆抗体的单克隆细胞系1B11-14-16,以及由该细胞系所分泌的抗MSH2蛋白单克隆抗体。本方案得到的抗体具有高特异性、敏感性,可以特异性识别表达MSH2蛋白的细胞,适用于免疫学检测,特别是免疫组化检测。附图说明图1:MSH2纯化后单抗的聚丙烯酰胺凝胶电泳图。图2:MSH2单抗检测人PD-1蛋白的免疫印迹图。图3:为结直肠癌组织免疫组化染色结果图(左为1B11-14-16的MSH2,右为市售MSH2)。图4:为膀胱癌组织免疫组化染色结果图(左为1B11-14-16的MSH2,右为市售MSH2)。图5:为扁桃体组织免疫组化染色结果图(左为1B11-14-16的MSH2,右为市售MSH2)。图6:为阑尾组织免疫组化染色结果图(左为1B11-14-16的MSH2,右为市售MSH2)。具体实施方式实施例1重组MSH2蛋白片段的制备一、基因克隆从Uniprot数据库(http://www.uniprot.org)中选择编号P43246的MSH2蛋白序列作为标准序列。依据其与DNA结合的结构、抗原性、组成氨基酸的亲疏水性以及二级结构,选择具有区别于其他类似蛋白、长度适宜且具有特殊抗原性的区域作为抗原肽。选定MSH2氨基酸序列第919位至第934位序列,其对应的核苷酸序列为SEQIDNo.1。合成以上MSH2蛋白,在其N端添加巯基修饰并与载体蛋白KLH偶联,提高其免疫原性,作为免疫原备用。实施例21B11-14-16杂交瘤细胞系的建立一、免疫将实施例1中获得的MSH2蛋白-KLH偶联物稀释至1mg/mL,然后与等体积的完全弗氏佐剂(CFA,Sigma公司)混合乳化,对18-20g的Balb/c小鼠(购自福州吴氏实验动物)进行腹部注射免疫,注射剂量为50μg/只。此后每14天加强免疫一次,抗原使用弗氏非完全佐剂(IFA,Sigma公司)乳化,剂量为25μg/只。第2次加强免疫后14天以间接ELISA(波长450nm)检测小鼠血清中抗免疫原的多抗效价,效价最高的小鼠以尾静脉注射冲击免疫,抗原用PBS溶液混匀,剂量为50μg/只。二、细胞融合无菌制备免疫达标的小鼠脾细胞悬液,与小鼠骨髓瘤细胞sp2/0(ATCC)以5:1比例混合,1000rpm离心10min,弃上清后,在1分钟内由慢到快加入1mL预热至37℃的PEG(Sigma公司)溶液,加入过程中需轻轻转动离心管,使细胞与PEG充分接触。室温静置90s后,2min内由慢到快加入4mL预热至37℃的无血清DMEM(Hyclone公司)培养基,随后的2min内再加入10mL预热无血清DMEM培养基,最后2min内加完剩余的预热无血清DMEM培养基,定容至50mL,整个加入过程需要缓慢摇动离心管,确保混合均匀,减轻对细胞的伤本文档来自技高网
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【技术保护点】
1.一种抗MSH2蛋白单克隆抗体,其特征在于,所述单克隆抗体重链和轻链可变区的氨基酸序列分别是SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列。

【技术特征摘要】
1.一种抗MSH2蛋白单克隆抗体,其特征在于,所述单克隆抗体重链和轻链可变区的氨基酸序列分别是SEQIDNO.2和SEQIDNO.3所示的氨基酸序列。2.根据权利要求1所述的单克隆抗体,其特征在于,所述单克隆抗体重链和轻链可变区氨基酸序列分别是SEQIDNO.4和SEQIDNO.5所示的核苷酸序列所编码。3.根据权利要求1所述的单克隆抗体,其特征在于,所述单克隆抗体特异性识别MSH2蛋白。4.根据权利要求3所述的单克隆抗体,其特征在于,所述单克隆抗体特异性识别MSH2蛋白中SEQIDNO.1所示的氨基酸序列。5.一种抗MSH2蛋白单克隆抗体,由保藏号为CGMCCNO.17405的杂交瘤细胞系产生。6.根据权利要求1所述的单...

【专利技术属性】
技术研发人员:李恢波王小亚李玲玲吴茂杨清海
申请(专利权)人:福州迈新生物技术开发有限公司
类型:发明
国别省市:福建,35

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