α-淀粉酶变体以及对其进行编码的多核苷酸制造技术

本发明专利技术涉及α‑淀粉酶变体。本发明专利技术还涉及编码这些变体的多核苷酸；包含这些多核苷酸的核酸构建体、载体、和宿主细胞；以及使用这些变体的方法。

Alpha-amylase variants and their coding polynucleotides

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】α-淀粉酶变体以及对其进行编码的多核苷酸序列表的引用本申请包含处于计算机可读形式的序列表，将其通过引用结合在此。专利技术背景
本专利技术涉及α-淀粉酶变体、编码这些变体的多核苷酸、产生这些变体的方法以及使用这些变体的方法。
技术介绍
α-淀粉酶(E.C.3.2.1.1)构成催化淀粉、糖原和相关多糖以及寡糖水解的一组酶。α-淀粉酶在商业上用于各种用途，如在淀粉加工(例如，液化)的初始阶段中；在湿式碾磨过程中；以及在从碳水化合物来源产生醇中。它们还用作清洗剂或在洗涤剂基质中的辅助物；在纺织工业中用于淀粉退浆；用于烘焙应用中；用于饮料行业中；用于油田的钻探过程中；在回收过程中例如用于使纸去墨；以及用于动物饲料中。用于例如淀粉液化的一些商业α-淀粉酶来源于地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)或嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillusstearothermophilus)。已经开发野生型酶的蛋白质工程化变体来克服过程问题。然而，仍然需要具有改进特性的新颖α-淀粉酶，如在低pH、低钙以及高温下的较高稳定性。这类酶将允许淀粉液化过程在降低的pH下进行，从而对于化学品节省具有积极影响。本专利技术的目标是提供在低pH下和/或在高温下，特别是在低钙浓度下具有增加稳定性的新颖α-淀粉酶变体。对于待用于淀粉液化过程中的α-淀粉酶，特别关注的是它是热稳定的并且能够在低pH和低钙浓度下起作用。改变的Ca2+稳定性意指在Ca2+消耗下的酶稳定性已得到改进，即更高或更低的稳定性。在本专利技术的上下文中，重要的突变(包括氨基酸取代)是实现改变的Ca2+稳定性(特别是在尤其低的pH(即pH4-6)下改进的Ca2+稳定性，即更高或更低的稳定性)的突变。WO2000/060059披露了在低Ca2+水平下具有增加的稳定性的特妙淀粉酶(Termamyl)样α-淀粉酶变体。WO2013/057143和WO2013/057141披露了来自液化芽孢杆菌(Bacillusliquefaciens)的α-淀粉酶变体，这些变体具有改进的特性，如在低钙浓度下具有增加的稳定性。本专利技术提供了与其亲本相比具有改进特性的α-淀粉酶变体。
技术实现思路
本专利技术涉及一种α-淀粉酶变体，该变体包含在对应于SEQIDNO:1的位置116、393、181、293、264、或196的位置处的取代，特别是选自下组的一个或多个取代，该组由以下组成：T116N、T116D、T116E、T116Q、T116Y、T181H、T181Q、S264K、L196D、H293Q、和Q393L，其中该变体与SEQIDNO:1的氨基酸1至483、或SEQIDNO:2的氨基酸1至481具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但小于100％的序列同一性；并且其中该变体具有α-淀粉酶活性。本专利技术还涉及编码这些变体的多核苷酸；包含这些多核苷酸的核酸构建体、载体以及宿主细胞；并且涉及包含本专利技术的这些变体的组合物；以及生产这些变体的方法。本专利技术还涉及用于从含淀粉材料生产糖浆的方法，该方法包括以下步骤：a)在如权利要求1-10中任一项所述的变体α-淀粉酶的存在下，在高于初始糊化温度的温度下，液化该含淀粉材料；和b)在葡糖淀粉酶的存在下糖化步骤a)的产物。定义α-淀粉酶变体：α-淀粉酶(E.C.3.2.1.1)是催化淀粉以及其他直链和支链1,4糖苷寡糖和多糖的水解的一组酶。本领域技术人员将知道如何确定α-淀粉酶活性。它可根据在实例中描述的程序例如通过PNP-G7测定或酶检(EnzCheck)测定来确定。在一方面，本专利技术的变体具有SEQIDNO:3的多肽的α-淀粉酶活性的至少20％，例如至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少100％。在一方面，本申请的变体具有其亲本的α-淀粉酶活性的至少20％，例如至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少100％。在另外的实施例中，本专利技术的变体α-淀粉酶与亲本α-淀粉酶(特别是如SEQIDNO:2的氨基酸1至481披露的亲本)相比具有增加的稳定性，并且其中该增加的稳定性被测量为在90℃、pH4.5、5ppmCa2+下孵育15分钟后通过酶检测定确定的残留α-淀粉酶活性。在一个实施例中，该残留活性是至少45％、至少50％、特别是至少55％。在另一个实施例中，本专利技术的变体α-淀粉酶能够产生具有右旋糖当量(DE)值高于由亲本α-淀粉酶(特别是如SEQIDNO:2的氨基酸1至481披露的亲本)产生的DE值的液化物。特别地，该DE值比由SEQIDNO:2的亲本α淀粉酶产生的DE值高至少2。等位基因变体：术语“等位基因变体”意指占据同一染色体基因座的基因的两种或更多种替代形式中的任一种。等位基因变异通过突变而自然产生，并且可以导致群体内部的多态性。基因突变可以是沉默的(所编码的多肽无变化)或可以编码具有改变的氨基酸序列的多肽。多肽的等位基因变体是由基因的等位基因变体编码的多肽。编码序列：术语“编码序列”意指多核苷酸，该多核苷酸直接规定了变体的氨基酸序列。编码序列的边界通常由可读框确定，该可读框以起始密码子(如ATG、GTG或TTG)开始并且以终止密码子(如TAA、TAG或TGA)结束。编码序列可为基因组DNA、cDNA、合成DNA或其组合。控制序列：术语“控制序列”意指对于表达编码本专利技术的变体的多核苷酸所必需的核酸序列。每个控制序列对于编码该变体的多核苷酸来说可以是原生的(即，来自相同基因)或外源的(即，来自不同基因)，或相对于彼此是原生的或外源的。这类控制序列包括但不限于前导序列、多聚腺苷酸化序列、前肽序列、启动子、信号肽序列、和转录终止子。最少，控制序列包括启动子、以及转录和翻译终止信号。出于引入促进控制序列与编码变体的多核苷酸的编码区域连接的特异性限制位点的目的，控制序列可以提供有接头。表达：术语“表达”包括涉及变体产生的任何步骤，包括但不限于转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰、以及分泌。表达载体：术语“表达载体”意指直链或环状DNA分子，该分子包括编码变体的多核苷酸并且可操作地连接至提供用于其表达的控制序列。片段：术语“片段”意指具有在成熟多肽的氨基和/或羧基末端不存在的一个或多个(例如，若干个)氨基酸的多肽；其中该片段具有α-淀粉酶活性。宿主细胞：术语“宿主细胞”意指易于用包含本专利技术的多核苷酸的核酸构建体或表达载体进行转化、转染、转导等的任何细胞类型。术语“宿主细胞”涵盖由于复制期间出现的突变而与亲本细胞不完全相同的任何亲本细胞子代。改进的特性：术语“改进的特性”意指与相对于亲本有所改进一种变体相关的特征。此类改进的特性包括但不限于增加的稳定性，该增加的稳定性被测量为在90℃、pH4.5、5ppmCa2+下孵育15分钟后通过酶检测定确定的残留α-淀粉酶活性；和/或这些变体能够产生具有右旋糖当量(DE)值高于由亲本α-淀粉酶产生的DE值的液化物。分离的：术语“分离的”意指处于自然界中不存在的形式或环境中的物质。分离的物质的非限制性实例包括(1)任何非天然存在的物质，(2)包括但不限于任何酶、变体、核酸、蛋白质、本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种α‑淀粉酶变体，该变体包含在对应于SEQ ID NO:1的位置116、393、181、293、264、或196的位置处的取代，特别是选自下组的一个或多个取代，该组由以下组成：T116N、T116D、T116E、T116Q、T116Y、T181H、T181Q、S264K、L196D、H293Q、和Q393L，其中该变体与SEQ ID NO:1的氨基酸1至483、SEQ ID NO:2的氨基酸1至481具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但小于100％的序列同一性；并且其中该变体具有α‑淀粉酶活性。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2016.11.29 US 62/427,6651.一种α-淀粉酶变体，该变体包含在对应于SEQIDNO:1的位置116、393、181、293、264、或196的位置处的取代，特别是选自下组的一个或多个取代，该组由以下组成：T116N、T116D、T116E、T116Q、T116Y、T181H、T181Q、S264K、L196D、H293Q、和Q393L，其中该变体与SEQIDNO:1的氨基酸1至483、SEQIDNO:2的氨基酸1至481具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但小于100％的序列同一性；并且其中该变体具有α-淀粉酶活性。2.如权利要求1所述的α-淀粉酶变体，该变体包含在对应于SEQIDNO:1的位置116、393、264、或196的位置处的取代，特别是选自下组的一个或多个取代，该组由以下组成：T116N、T116D、T116Q、T116Y、S264K、L196D、Q393L、和T116D+L196D；其中该变体与亲本α-淀粉酶相比具有增加的稳定性，该亲本α-淀粉酶选自下组，该组由以下组成：SEQIDNO:1的氨基酸1至483、或SEQIDNO:2的氨基酸1至481，并且其中该增加的稳定性被测量为在90℃、pH4.5、5ppmCa2+下孵育15分钟后通过酶检测定确定的残留α-淀粉酶活性。3.如权利要求2所述的α-淀粉酶变体，该变体包含选自以下的取代或选自以下的取代的组合：T116N；T116D；T116Q；T116E；T116Y；S264K；L196D；Q393L；和T116D+L196D(使用SEQIDNO:1进行编号)；其中该变体与SEQIDNO:2的氨基酸1至481具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但小于100％的序列同一性，并且该残留α-淀粉酶活性是至少45％、至少50％、特别是至少55％。4.如权利要求1所述的α-淀粉酶变体，该变体包含在对应于SEQIDNO:1的位置116、181、393、264、或293的位置处的取代，特别是选自下组的一个或多个取代，该组由以下组成：T116N、T116D、T116Q、T116E、T116Y、T181H、T181Q、S264K、H293Q、和Q393L，其中该变体能够产生具有右旋糖当量(DE)值高于由亲本α-淀粉酶产生的DE值的液化物，该亲本α-淀粉酶选自下组，该组由以下组成：SEQIDNO:1的氨基酸1至483、或SEQIDNO:2的氨基酸1至481。5.如权利要求4所述的α-淀粉酶变体，该变体包含选自以下的取代或选自以下的取代的组合：T116N；T116D；T116Q；T116E；T116Y；T181Q；T181H；S264K；Q393L；和H293Q(使用SEQIDNO:1进行编号)；其中该变体与SEQIDNO:2的氨基酸1至481具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但小于100％的序列同一性，并且其中该DE值比由SEQIDNO:2的亲本α淀粉酶产生的DE值高至少2。6.如权利要求5所述的α-淀粉酶变体，其中该变体能够产生具有右旋糖当量(DE)值在从12.5至22的范围内、特别是从13至21的范围内的液化物。7.如权利要求1所述的变体，其中该变体α-淀粉酶是分离的。8.如权利要求1所述的变体，其中取代的...

【专利技术属性】
技术研发人员：T吉本斯，C安德森，PV拉奥，
申请(专利权)人：诺维信公司，
类型：发明
国别省市：丹麦,DK