一种单核苷酸多态性的等温分型方法技术

本发明专利技术属于分子生物学技术领域，提供一种等温条件下单核苷酸多态性(SNP)分型方法。该方法首先根据含SNP位点的目标序列设计相应的环介导等温扩增(LAMP)引物，保证SNP位点能出现在LAMP中间产物的单链环上除内引物互补序列外的大环区域。同时通过SNP所在的单链环区设计可特异性识别野生型和突变型SNP位点的短链寡核苷酸探针，利用不同类型寡核苷酸探针与LAMP中间产物的单链环区杂交稳定性的不同导致的扩增效率的显著差异来实现SNP的高分辨分型。该方法在等温条件下进行，无需精密的变温设备，便捷、准确、分辨率高，分型过程无需开盖操作，可以实现一步分型，适合于现场检测。

Isothermal typing of single nucleotide polymorphisms

【技术实现步骤摘要】
一种单核苷酸多态性的等温分型方法
本专利技术属于分子生物学
，涉及单核苷酸多态性的等温检测与分型，具体涉及一种普适的利用短链寡核苷酸探针与环介导等温扩增中间产物的含SNP位点的单链环区的特异性杂交互补，将单核苷酸多态性的分型与探针对环介导等温扩增反应效率的作用相联系的方法。
技术介绍
单核苷酸多态性(singlenucleotidepolymorphism，SNP)是由单个核苷酸突变引发的个体之间的差异。SNP是人类基因组中最常见的突变形式，当前已经报导的SNP超过了900万。随着SNP概念的广泛使用，当前SNP不仅包含单个核苷酸的转换与颠换，还包含了位点的插入、缺失，且这些突变形式在人群中的频率不低于1％。由于SNP在基因中的广泛分布，出现在不同位置的SNP能够影响机体的生理与病理相关变化。当前SNP已经作为第三代分子标记帮助研究人员及临床医生进行更明确的诊断，如利用SNP对某些肿瘤的易感性做出预测。在药物基因组学检测中，SNP能够用于预测某些药物在不同个体的有效性，例如华法林的给药剂量就与CYP2C9基因多态性密切相关。SNP的分型是对纯合型与杂合型的SNP位点进行有效的区分，这种精确的分型能够有效的确定基因组中某一基因的功能状态，对于临床检测以及药物基因组学研究均具有重要意义。核酸的扩增是分子检测领域的主要内容，当前最常用的方法是聚合酶链式反应(Polymerasechainreaction,PCR)。PCR是一种变温扩增手段，通过高温变性、低温退火、中温延伸对靶分子实现扩增。核酸分子的等温扩增是不依赖于变温过程，通过特定的酶在恒定温度下的对核酸分子进行扩增。2000年日本研究人员Notomi及其同事报导了一种新型的环介导的等温扩增技术(Loop-mediatedisothermalamplification,LAMP)。LAMP是一种基于酶促反应的DNA体外等温扩增方法，利用两对特殊设计的引物(内引物与外引物)分别针对靶分子序列的六个不同区域，在具有链置换活性的DNA聚合酶的作用下产生带有“茎环”结构的初始扩增产物，该产物能够以自身为模板进行延伸。与此同时，内引物也能结合到该初始产物的单链环区引发扩增。最终，经过不断的链置换以及内引物的结合，LAMP反应最终产生大量带有交替反向重复序列的不同长度的DNA大分子片段。除了内引物外，2002年Notomi等人根据LAMP产物的单链环区的不同于内引物结合区的区域设计了环引物(loopprimer)，环引物的引入能够使LAMP反应的效率得到显著增强。该方法具有高特异性、高扩增效率以及成本低的特点，目前LAMP方法已经成为最常用的等温扩增手段之一。LAMP反应的监控可以通过实时荧光报告的方式以及终点荧光报告法，近年来，有报导利用金属离子指示剂萘酚蓝(hydroxynaphtholblue，HNB)以及pH指示剂中性红(neutralred,N-red)作为一步可视化的报告方法，使LAMP技术在床边检测(POCT)领域具有更大的潜能。当前SNP的分型方法主要基于PCR的扩增，例如TaqMan技术、高分辨溶解曲线分析(HRM)、位点特异性PCR等等。尽管这些方法具有高灵敏度、高特异性等特点，然而其对于精密的变温设备的依赖使其在床边检测(POCT)中受到一定的限制，而基于等温扩增的检测方法能够排除该限制，在POCT领域具有广泛的应用前景。近年来，基于LAMP的SNP检测方法也受到越来越多的关注，其中报导最多的是位点特异性的LAMP(AS-LAMP)。AS-LAMP通过将检测SNP位点的碱基设计在LAMP内引物的末端，当内引物末端碱基与待检测SNP位点碱基互补，内引物与模板可发生完美的互补配对，那么LAMP就能正常进行，而内引物末端碱基不与待检测SNP位点碱基互补，那么就会影响DNA聚合酶在该位置的有效延伸，从而停止LAMP反应的进行。总的来说，AS-LAMP的原理是依赖于DNA聚合酶对于错配的识别能力，但是，很多用于等温扩增的DNA聚合酶能够在出现末端错配的情况下继续延伸，这在一定程度上限制了AS-LAMP的准确性。此外，AS-LAMP必须要求SNP固定于内引物的末端，这增加了LAMP引物设计的复杂性。因此，开发一种等温、精确、经济、便捷的SNP分型方法在实现POCT中具有长足的意义。
技术实现思路
本专利技术提供一种等温条件下的SNP分型方法，该方法在LAMP扩增基础上借鉴环引物设计思想设计SNP特异性寡核苷酸探针，使SNP能够通过探针对LAMP扩增效率的显著影响得到更好的分型效果。其技术方案如下：选择含SNP位点的DNA片段作为目标DNA，根据LAMP引物设计原理进行引物设计，并确保SNP位点位于环引物设计区域(LAMP扩增中间产物的单链环区上除内引物互补序列外的大环序列)；以SNP位点所在大环序列为基础，设计能特异性识别SNP位点并与含SNP位点的目标序列互补的短链寡核苷酸探针，使探针上与SNP位点对应的碱基表现出与SNP位点互补或错配的特性；采用通用LAMP反应条件，利用LAMP引物和SNP寡核苷酸探针对目标DNA进行扩增；由于SNP位点的突变与否可显著影响环引物短链杂交探针与单链环结合的稳定性，而环引物的延伸能够显著提高LAMP的扩增效率，故当短链杂交探针与对应的含SNP的单链环序列完美互补时，短链探针可正常延伸，能够显著增强LAMP反应的效率，而当短链杂交探针与对应的含SNP的单链环出现单个碱基的错配时，短链探针则无法稳定的结合到单链环上，故不能对LAMP反应产生增强效果，由此，便可通过扩增效率的显著差异实现高分辨率的SNP分型。本专利技术所涉及的短链寡核苷酸探针应根据SNP位点对应的碱基类型不同而同时设计不同类型的探针，使其能够对纯合野生型、纯合突变型和杂合性的基因型进行特异性区分。进行SNP分型时，运用针对于SNP位点的不同类型的探针对同一核酸样本进行平行检测，分型结果通过平行反应之间的信号差异来判断。针对同一核酸样本用不同类型探针平行检测，存在显著信号差异为纯合型，不存在显著差异为杂合型；纯合型中，与野生型SNP位点互补的探针参与的反应获得较高信号时，判断为纯合野生型，与突变型SNP位点互补的探针参与的反应获得较高信号时，判断为纯合突变型。本专利技术所涉及寡核苷酸探针是一种短链杂交探针，长度依赖于环介导等温扩增反应温度对探针与含SNP的目标序列的杂交互补程度的控制，故在设计时，需保证探针能在LAMP反应温度条件下与目标DNA的杂交能够通过单个碱基的差异来控制，以实现高分辨的SNP分型；长度优选为10-12个核苷酸。本专利技术所涉及寡核苷酸探针在设计时，对应SNP的核苷酸位点可设计在探针的任意位置，以保证探针与目标序列的互补结合能够通过单个碱基差异实现高分辨SNP分型为宜；将SNP置于探针的中间位置，可以获得最佳的SNP分型效果。本专利技术所涉及的短链寡核苷酸探针以环引物设计区域即LAMP反应中间产物单链环上区别于内引物设计区域的大环序列为对象进行设计，相对于AS-LAMP将SNP位点设计于内引物末端的方案，受模板序列、LAMP引物设计规则的影响较小，且该设计能够使LAMP引物的设计更为灵活、简单。AS-LAMP对SNP的分型依赖于DNA聚合酶对于错配本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种单核苷酸多态性(SNP)等温分型方法，其特征是：根据SNP位点所在区域设计合适的环介导等温扩增反应的引物，使SNP出现在环介导等温扩增中间产物的单链环上，根据单链环序列设计对应的能够特异性识别SNP位点的短链寡核苷酸探针，使其与中间产物的SNP所在区域进行杂交，当其与SNP区域完全互补时，该探针即可使环介导等温扩增反应效率获得巨大的增益效果，若探针与SNP区域不完全互补，则该探针不能稳定的结合至单链环区，因此不能对环介导等温扩增反应有增益效果，由此，通过探针与含SNP位点序列的互补程度的不同导致的扩增效率的显著差异即可实现SNP的准确分型。

【技术特征摘要】
1.一种单核苷酸多态性(SNP)等温分型方法，其特征是：根据SNP位点所在区域设计合适的环介导等温扩增反应的引物，使SNP出现在环介导等温扩增中间产物的单链环上，根据单链环序列设计对应的能够特异性识别SNP位点的短链寡核苷酸探针，使其与中间产物的SNP所在区域进行杂交，当其与SNP区域完全互补时，该探针即可使环介导等温扩增反应效率获得巨大的增益效果，若探针与SNP区域不完全互补，则该探针不能稳定的结合至单链环区，因此不能对环介导等温扩增反应有增益效果，由此，通过探针与含SNP位点序列的互补程度的不同导致的扩增效率的显著差异即可实现SNP的准确分型。2.根据权利要求1所述的SNP等温分型方法，其特征是：所述LAMP引物的设计应确保SNP位点位于环介导等温扩增中间产物的单链环上除内引物互补序列外的大环区域。3.根据权利要求1所述的短链寡核苷酸探针，其特征是一种短链杂交探针，长度依赖于环介导等温扩增反应温度对探针与含SNP的目标序列的杂交互补程度的控制，以保证探针与目标序列的互补结合能够通过单个碱基的差异实现高分辨的SNP分型为宜，优选为10-12个核苷酸。4.根据权利要求1所述的短链寡核苷酸探针，其特征是对应SNP的核苷酸位点可设计在探针的任意位置，以保证探针与目标序列的互补结合能够通过单个碱基的差异实现高分辨的SNP分型为宜；对应SNP的核苷酸位置出现在探针中间，可以使分型效果更明显。5.根据权利要求1所述的SNP等温分型方...

【专利技术属性】
技术研发人员：唐卓，丁盛，陈刚毅，董娟，
申请(专利权)人：中国科学院成都生物研究所，
类型：发明
国别省市：四川,51