一种真姬菇的原生质体制备方法技术

本发明专利技术提供一种真姬菇的原生质体制备方法，改变传统装有PDB培养基锥形瓶摇床培养产生球状菌丝提取原生质体方法，采样带玻璃渣的静置培养、定期摇瓶的培养菌丝及无菌尼龙网过滤方法，选取不同的菌丝菌龄、溶壁酶酶液浓度、酶解时间、过滤离心速率及时间等，并根据原生质体直径大小采用G2漏斗过滤原生质体等，吸取20ul滴于血球计数板上，在40倍的光学显微镜下镜检，计数，形成整套真姬菇原生质体制备方法。采用本发明专利技术方法，真姬菇原生质体数量达到1.0‑2.2×10

A Method for Preparing Protoplast of Agaricus blazei

【技术实现步骤摘要】
一种真姬菇的原生质体制备方法
本专利技术属于生物工程中微生物育种的方法，特别涉及一种真姬菇的原生质体制备方法。
技术介绍
食用菌产业在农业经济中占有重要地位，“点草成金，变废为宝”，实现循环经济，是可持续发展农业。真姬菇（Hypsizigusmarmoreus），又称为斑玉蕈、玉蕈、白玉、海鲜菇、鸿喜菇等，味比平菇鲜，质比香菇韧，肉比滑菇厚，具有蟹香独特的味道，其属于真菌界（Fungi）、担子菌门（Basidiomycotina）、伞菌纲（Agaricomycetes）、伞菌目（Agaricales）、离褶伞科（LyopHyllaceae）、玉蕈属（Hypsizigus），是北温带一种珍稀名贵的食用真菌，适于北温带春秋季及冬季栽培，自然分布于欧洲、西伯利亚、日本及北美等地。本文从菌丝出发对真姬菇原生质体的制备的关键因素进行了探索性研究，为利用原生质体高效遗传转化技术和原生质体融合技术培育多功能新型菌株奠定基础。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种真姬菇的原生质体的制备方法，使其原生质体的制备率达到1.0-2.2×107个/mL。为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：本专利技术的技术方案是:（1）接健壮真姬菇菌丝到PDA菌体培养基平板上，24℃避光培养144h-240h。选择生长健壮的菌丝平板，接菌丝于150ml带有玻璃渣的PDB液体培养基中，玻璃渣大小为0.5-1cm×0.4cm×0.2cm，避光静置培养96h-120h，培养48h后，每8h手动摇动锥形瓶10min，割断新长的菌丝。120h后转接50ml含有健壮菌丝的液体培养基到120ml带碎玻璃渣PDB液体培养基中，再次静置培养48h-144h，每8h于250rpm，24℃摇床培养1h。（2）在超净工作台内，用二层无菌尼龙纱布过滤出菌丝，用无菌水冲洗，接着用0.6mol/L甘露醇清洗2次，用灭菌的滤纸吸干。用0.6mol/L甘露醇溶液配制的含1-4wt.%溶壁酶的酶液，菌丝：酶液按1:10g/mL比例添加到装有菌丝体的离心管内，将离心管放入30℃水浴锅中酶解1-4h，每30min，上下颠覆摇匀20次。（3）在超净工作台内，用G2漏斗过滤粗提液到离心管中并封口，在高速离心机3000-6000rpm条件下离心10min，倒掉上清液，用移液枪吸取5ml稳渗剂加入到离心管中，将沉淀混匀，重复3000-6000rpm条件下离心10min，倒掉上清，加1ml稳渗剂，将沉淀混匀。吸取20ul滴于血球计数板上，在40倍的光学显微镜下镜检，计数。原生质体数量达到1.0-2.2×107个/mL。所述的真姬菇的原生质体制备方法，最佳工艺参数是:（1）接健壮真姬菇菌丝到PDA菌体培养基平板上，24℃避光培养200h；选择生长健壮的菌丝平板，接菌丝于带有玻璃渣的150mlPDB液体培养基中，玻璃渣大小为0.5-1cm×0.4cm×0.2cm，避光静置培养110h，培养48h后，每8h手动摇动锥形瓶10min，割断新长的菌丝；120h后转接50ml含有健壮菌丝的液体培养基到另外120ml带碎玻璃渣PDB液体培养基中，再次静置培养96h，每8h于250rpm，24℃摇床培养1h；（2）在超净工作台内，用二层无菌尼龙纱布过滤出菌丝，用无菌水冲洗，接着用0.6mol/L甘露醇清洗2次，用灭菌的滤纸吸干，用0.6mol/L甘露醇溶液配制的含2wt.%溶壁酶的酶液，菌丝：酶液按1:10g/mL比例添加到装有菌丝体的离心管内，将离心管放入30℃水浴锅中酶解3h，每30min，上下颠覆摇匀20次；（3）在超净工作台内，用G2漏斗过滤粗提液到离心管中并封口，在高速离心机4000rpm条件下离心10min，倒掉上清液，用移液枪吸取5ml稳渗剂加入到离心管中，将沉淀混匀，重复4000rpm条件下离心10min，倒掉上清，加1ml稳渗剂，将沉淀混匀。吸取20ul滴于血球计数上，在40倍的光学显微镜下镜检，计数。原生质体数量达到2.2×107个/mL以上。本专利技术效果是:本申请真姬菇的原生质体制备方法，改变传统摇床摇菌，长出球状菌丝为静止培养，玻璃渣割断菌丝，不断长出幼嫩菌丝。探索不同菌龄、酶解时间、酶液浓度、过滤离心速率及过滤仪器等一些列关键技术点，形成特有提取真姬菇原生质体提取方法，解决了长期以来真姬菇原生质体制备提取率低的问题，为真姬菇遗传转化等分子生物学研究打下坚实基础。1．制备工艺简单，易操作；2．原生质体的制备率达到2.2×107个/mL以上，再生率达40%。附图说明图1不同菌龄对原生质体的影响。图2不同酶解时间对原生质体的影响。图3不同酶浓度对原生质体的影响。图4不同离心速度对原生质体的影响。具体实施方式一种真姬菇的原生质体制备方法提供了适合制备真姬菇原生质体数量的方法。实施例1-5所用的真姬菇为福建农林大学基因组与生物技术研究中心保藏菌株，菌株编号为Hy61。实施例1：（1）接健壮真姬菇菌丝到PDA菌体培养基平板上，24℃避光培养200h。编号为A1、A2、A3，B1、B2、B3。（2）选择生长健壮的菌丝平板，接菌丝于3瓶150ml带有玻璃渣的PDB液体培养基的250ml锥形瓶中编号为A1、A2、A3，玻璃渣大小为0.5-1cm×0.4cm×0.2cm，避光静置培养110h，培养48h后，每8h手动摇动锥形瓶10min，割断新长的菌丝，120h后转接50ml含有健壮液体菌丝到另外120ml带有碎玻璃渣PDB液体培养基中，再次培养96h，每8h置于250rpm，24℃摇床培养1h；选择生长健壮的菌丝平板，接菌丝于3瓶150ml带有细玻璃珠(r=0.1cm)的PDB液体培养基250ml锥形瓶中，编号为B1、B2、B3，放入250rpm，24℃摇床培养，120h后转接50ml含有健壮液体菌丝到另外带有细玻璃珠的120mlPDB液体培养基中，250rpm，24℃摇床培养72h。（3）在超净工作台内，将6瓶培养的菌丝分别用二层无菌尼龙纱布过滤出菌丝，用无菌水冲洗，接着用0.6mol/L甘露醇清洗2次，用灭菌的滤纸吸干；用0.6mol/L甘露醇溶液配制的含2wt.%溶壁酶的酶液，菌丝：酶液按1:10g/mL比例添加到装有菌丝体的离心管内，酶液用细菌过滤器过滤，现配现用，将离心管放入30℃水浴锅中酶解3h，每30min，上下颠覆摇匀20次。（4）在超净工作台内，用G2漏斗过滤粗提液到离心管中并封口，在高速离心机4000rpm条件下离心10min，倒掉上清液，用移液枪吸取5ml稳渗剂加入到离心管中，将沉淀混匀，重复4000rpm条件下离心10min，倒掉上清，加1ml稳渗剂，将沉淀混匀。吸取20ul滴于血球计数板上，在40倍的光学显微镜下镜检，计数，结果见表1。表1原生质体获得时培养方式筛选由表1可得，最适的菌丝培养方式为带玻璃渣的静止培养，定期摇匀，割断菌丝。实施例2：（1）接健壮真姬菇菌丝到PDA菌体培养基平板上，24℃避光培养200h。选择生长健壮的菌丝平板，接菌丝于150ml带有玻璃渣的PDB液体培养基中（玻璃渣大小为0.5-1cm×0.4cm×0.2cm），避光静置培养110h，培养48h后，每8h手动摇动锥形瓶10min，割断新长的菌丝。120h后转接50ml含有健壮液体菌丝到另外本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种真姬菇的原生质体制备方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）接健壮真姬菇菌丝到PDA菌体培养基平板上，24℃避光培养144h‑240h；选择生长健壮的菌丝平板，接菌丝于带有玻璃渣的150mlPDB液体培养基中，玻璃渣大小为0.5‑1cm×0.4 cm×0.2cm，避光静置培养96h‑120h，培养48h后，每8h手动摇动锥形瓶10min，割断新长的菌丝；120h后转接50ml含有健壮菌丝的液体培养基到另外120ml带碎玻璃渣PDB液体培养基中，再次静置培养48h‑144h， 每8h于250rpm，24℃摇床培养1h；（2）在超净工作台内，用二层无菌尼龙纱布过滤出菌丝，用无菌水冲洗，接着用0.6mol/L甘露醇溶液清洗2次，用灭菌的滤纸吸干；用0.6mol/L甘露醇溶液配制的含1‑4wt.%溶壁酶的酶液，菌丝：酶液按1:10g/mL比例添加到装有菌丝体的离心管内，将离心管放入30℃水浴锅中酶解1‑4h，每30min，上下颠覆摇匀20次；（3）在超净工作台内，用G2漏斗过滤粗提液到离心管中并封口，在高速离心机3000‑6000rpm 条件下离心10min，倒掉上清液，用移液枪吸取5ml稳渗剂加入到离心管中，将沉淀混匀，重复3000‑6000rpm 条件下离心10min，倒掉上清，加1ml稳渗剂，将沉淀混匀；吸取20ul滴于血球计数板上，在40倍的光学显微镜下镜检，计数。...

【技术特征摘要】
1.一种真姬菇的原生质体制备方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）接健壮真姬菇菌丝到PDA菌体培养基平板上，24℃避光培养144h-240h；选择生长健壮的菌丝平板，接菌丝于带有玻璃渣的150mlPDB液体培养基中，玻璃渣大小为0.5-1cm×0.4cm×0.2cm，避光静置培养96h-120h，培养48h后，每8h手动摇动锥形瓶10min，割断新长的菌丝；120h后转接50ml含有健壮菌丝的液体培养基到另外120ml带碎玻璃渣PDB液体培养基中，再次静置培养48h-144h，每8h于250rpm，24℃摇床培养1h；（2）在超净工作台内，用二层无菌尼龙纱布过滤出菌丝，用无菌水冲洗，接着用0.6mol/L甘露醇溶液清洗2次，用灭菌的滤纸吸干；用0.6mol/L甘露醇溶液配制的含1-4wt.%溶壁酶的酶液，菌丝：酶液按1:10g/mL比例添加到装有菌丝体的离心管内，将离心管放入30℃水浴锅中酶解1-4h，每30min，上下颠覆摇匀20次；（3）在超净工作台内，用G2漏斗过滤粗提液到离心管中并封口，在高速离心机3000-6000rpm条件下离心10min，倒掉上清液，用移液枪吸取5ml稳渗剂加入到离心管中，将沉淀混匀，重复3000-6000rpm条件下离心10min，倒掉上清，加1ml稳渗剂，将沉淀混匀；吸取20ul滴于血球计数板上，在...

【专利技术属性】
技术研发人员：张积森，王刚，常小光，林婧娴，郭琳，王园园，
申请(专利权)人：福建农林大学，
类型：发明
国别省市：福建,35