一种从口虾蛄中提取高纯度金属硫蛋白的方法技术

本发明专利技术涉及金属硫蛋白提取技术领域，为解决有金属硫蛋白提取工艺存在的提取对象要求苛刻、提取周期长、成本高、纯度低的问题，提供了一种从口虾蛄中提取高纯度金属硫蛋白的方法，包括以下步骤：(1)将口虾蛄去壳，取可食部分，匀浆，离心提取冷冻干燥；(2)进行凝胶过滤层析；(3)进行阴离子交换层析；(4)进行脱盐处理，得第一亚型金属硫蛋白和第二亚型金属硫蛋白。本发明专利技术以口虾蛄可食部分为原料，针对口虾蛄自身特有的基质特点设计高纯度金属硫蛋白的提取工艺，该工艺提取周期短，提取量大，且成本低，纯度高，适合工厂化、规模化生产。

A Method for Extracting High Purity Metallothionein from Crayfish

【技术实现步骤摘要】
一种从口虾蛄中提取高纯度金属硫蛋白的方法
本专利技术涉及金属硫蛋白提取
，尤其涉及一种从口虾蛄中提取高纯度金属硫蛋白的方法。
技术介绍
金属硫蛋白(metallothionein，MT)是富含半胱氨酸(Cys)的低分子量蛋白质(6000～7000Da)，通过其半胱氨酸硫醇基团对重金属具有结合能力，能够结合多达20个单价或7个二价重金属离子。MT在生物体内发挥重要的生理作用，主要表现为参与生物体内微量金属元素的储存、运输及代谢和对非必需重金属元素的螯合解毒，此外在调节内环境的稳态、清除自由基、防止组织氧化损伤、拮抗生理和生化反应等方面也有很重要的意义，并为其他金属蛋白和金属酶类提供活性中心，因此MT在环境监测、保健食品与医药领域具有十分广泛的应用。目前MT主要从哺乳动物(如人、大鼠、小鼠及家兔等)和一些细菌及真菌中提取纯化。但现阶段无有效的技术对其进行大批量生产，限制了其开发和应用。其高纯度物售价高，目前市场在售的仅能买到国内一家公司生产的兔肝物，标注纯度在95％以上，售价约1500元/5mg，但不具备标准物质证书，实际纯度有待考究。口虾蛄(Oratosquillaoratoria)，别称皮皮虾、虾耙子、瀨尿虾，属甲壳纲，是一种多年生大型底栖甲壳类动物，在我国及日本、菲律宾沿海均有分布，资源量较大，2014年我国口虾蛄产量达29.4万吨。因其营养丰富、肉质鲜美，口虾蛄一直受到广大消费者的青睐，是我国沿海地区具有代表性的高值甲壳类产品。近年来质检机构检测发现口虾蛄镉含量超标现象严重，铜、砷、锌等元素含量也较高，表明口虾蛄是一种对海洋环境中微量元素富集能力较强的海洋生物。金属元素的胁迫会诱导生物体内MT的表达，因此口虾蛄可以作为提取MT的良好原料。以口虾蛄为原料提取与纯化制备金属硫蛋白，一方面为海洋生物资源的开发和利用提供新的思路，另一方面也为后续开展口虾蛄富集镉机理究打下基础，对保护生态环境和类健康也有重要的意义。中国专利文献上公开了“一种从虾夷扇贝中同时提取两种亚型金属硫蛋白的方法”，申请公布号为CN109206507A，该专利技术通过氯化锌诱导、多次离心提取、用填料为聚甲基丙烯酸酯的分子筛预装柱一次纯化及阴离子交换层析二次纯化的方法从虾夷扇贝内脏中提取金属硫蛋白。但是，该专利技术的提取对象仅针对活体虾夷扇贝的内脏，而内脏部分是虾夷扇贝整个组织中较少的一部分，且前期需要采用氯化锌来诱导虾夷扇贝，活体培养数天，生产周期长；且采用商品化的分子筛预装柱，需要配套相应的自动蛋白纯化仪，设备成本高；目前商品化的分子筛预装柱柱容量较小，价格昂贵，可纯化上样量极受限制生产成本，不利于工厂化、规模化生产；提取纯度仅能达到87％。因此，该提取工艺存在着提取对象要求苛刻、周期长、成本高、纯度低的问题。
技术实现思路
本专利技术为了克服现有金属硫蛋白提取工艺存在的提取对象要求苛刻、提取周期长、成本高、纯度低的问题，提供了一种从口虾蛄中提取高纯度金属硫蛋白的方法，该方法提取周期短，提取量大，且成本低，纯度高，适合工厂化、规模化生产。为了实现上述目的，本专利技术采用以下技术方案：一种从口虾蛄中提取高纯度金属硫蛋白(MT)的方法，包括以下步骤：(1)将口虾蛄去壳，取可食部分，匀浆，离心提取，冷冻干燥，得口虾蛄金属硫蛋白粗提物；(2)将口虾蛄金属硫蛋白粗提物复溶，离心，用滤膜过滤，进行凝胶柱层析，收集洗脱液，冷冻干燥，得金属硫蛋白混合物；选用凝胶柱层而不用柱色谱分离是考虑到柱色谱分离上样量小、需要价格较为昂贵的制备色谱设备；(3)将金属硫蛋白混合物复溶，进行阴离子交换层析，分别收集两种亚型金属硫蛋白洗脱液，冷冻干燥，得第一亚型金属硫蛋白粗产物和第二亚型金属硫蛋白粗产物；(4)分别对第一亚型金属硫蛋白粗产物和第一亚型金属硫蛋白粗产物复溶，进行脱盐处理，得第一亚型金属硫蛋白和第二亚型金属硫蛋白。口虾蛄是一种对海洋环境中微量镉富集能力较强的海洋生物。金属元素的胁迫会诱导生物体内MT的表达，因此口虾蛄可以作为提取MT的良好原料。以口虾蛄为原料提取与纯化制备金属硫蛋白，一方面为海洋生物资源的开发和利用提供新的思路，另一方面也为后续开展口虾蛄富集镉机理究打下基础，对保护生态环境和类健康也有重要的意义。本专利技术采用口虾蛄去壳后的可食部分，即整体组织为原料直接提取金属硫蛋白，原料只需保证新鲜度即可，不一定是活体，更不需要后期的金属溶液诱导培养，减少了金属硫蛋白的制备工艺复杂程度，缩短生产周期，降低生产成本。由于不同来源的水生物提取金属硫蛋白的工艺及处理参数各不相同，因此，本专利技术的提取方法仅针对于口虾蛄可食部分中金属硫蛋白的提取，对其他来源的金属硫蛋白的提取可能并不适用，与此同时，其他来源的金属硫蛋白的提取方法对本专利技术的参照性也不强。作为优选，步骤(1)中，离心提取工艺为：加入Tris-HCl缓冲液，在45～55℃搅拌提取1～2h，将提取液高速冷冻离心，收集上清液a加热至70～80℃保温3～7min，；快速冷却至室温后再次高速冷冻离心，收集上清液b，加入无水乙醇，-18～-25℃过夜沉淀；再次高速冷冻离心，取沉淀物加入超纯水充分溶解，再次高速冷冻离心，收集上清液c冷冻干燥后得到口虾蛄金属硫蛋白粗提物。口虾蛄肉质含水分较多，肉味鲜甜嫩滑，淡而柔软，本专利技术针对口虾蛄自身特有的基质特点，设计上述离心提取工艺的步骤及参数。首先采用Tris-HCl缓冲液对口虾蛄可食部分在到45～55℃先提取1～2h，该步骤的作用是把组织中的金属硫蛋白物充分提取出来；将提取液高速冷冻离心后所得的上清液a加热至70～80℃以去除热不稳定大分子蛋白，处理温度过低，会导致杂蛋白去除不干净，过高会导致本身的金属硫蛋白可能会变性沉淀；最后所得沉淀物加入超纯水充分溶解，而不选用Tris-HCl缓冲液的好处是避免制备物中引入过多的盐分。作为优选，步骤(1)中，所述Tris-HCl缓冲液的pH为7.5～8.0，浓度为0.02～0.05mol/L；当Tris-HCl缓冲液的浓度为0.02mol/L，pH为7.8时，对口虾蛄中所含金属硫蛋白的提取效果最好。作为优选，步骤(1)中，所述无水乙醇经预冷过且保持温度为4℃，加入量为上清液b体积的3倍。乙醇作为有机溶剂能使金属硫蛋白脱水变性，本专利技术利用乙醇使金属硫蛋白发生可逆变性沉淀进一步与上清液b中的其它杂蛋白等分子发生分离。当乙醇的使用量为上清液b体积的3倍时，金属硫蛋白完全变性沉淀下来。作为优选，步骤(1)中，所述口虾蛄与Tris-HCl缓冲液的料液比(3～6)：1g/mL。Tris-HCl缓冲液的用量不宜过多，稀释倍数过大不利于对金属硫蛋白的提取，控制在上述料液比提取效果较佳。作为优选，步骤(1)中，高速冷冻离心的温度控制在4～10℃，转速控制在10000～15000r/min，离心时间控制在20～30min。高速冷冻离心的参数是提取效果的关键点，转速过高，增加能耗，过低会导致离心效果不好；离心温度过低，会增加能耗，过高可能会对金属硫蛋白结构及活性有影响。作为优选，步骤(2)中，凝胶过滤层析的条件为：柱层析填料为交联葡聚糖凝胶G50；流动相为0.02mol/L、pH＝8.0的Tris-HCl缓冲液；流速为0.8mL/min；洗脱体积500mL，收集量8m本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种从口虾蛄中提取高纯度金属硫蛋白的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)将口虾蛄去壳，取可食部分，匀浆，离心提取，冷冻干燥，得口虾蛄金属硫蛋白粗提物；(2)将口虾蛄金属硫蛋白粗提物复溶，离心，用滤膜过滤，进行凝胶过滤层析，收集洗脱液，冷冻干燥，得金属硫蛋白混合物；(3)将金属硫蛋白混合物复溶，进行阴离子交换层析，分别收集两种亚型金属硫蛋白洗脱液，冷冻干燥，得第一亚型金属硫蛋白粗产物和第二亚型金属硫蛋白粗产物；(4)分别对第一亚型金属硫蛋白粗产物和第一亚型金属硫蛋白粗产物复溶，进行脱盐处理，得第一亚型金属硫蛋白和第二亚型金属硫蛋白。

【技术特征摘要】
1.一种从口虾蛄中提取高纯度金属硫蛋白的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)将口虾蛄去壳，取可食部分，匀浆，离心提取，冷冻干燥，得口虾蛄金属硫蛋白粗提物；(2)将口虾蛄金属硫蛋白粗提物复溶，离心，用滤膜过滤，进行凝胶过滤层析，收集洗脱液，冷冻干燥，得金属硫蛋白混合物；(3)将金属硫蛋白混合物复溶，进行阴离子交换层析，分别收集两种亚型金属硫蛋白洗脱液，冷冻干燥，得第一亚型金属硫蛋白粗产物和第二亚型金属硫蛋白粗产物；(4)分别对第一亚型金属硫蛋白粗产物和第一亚型金属硫蛋白粗产物复溶，进行脱盐处理，得第一亚型金属硫蛋白和第二亚型金属硫蛋白。2.根据权利要求1所述的一种从口虾蛄中提取高纯度金属硫蛋白的方法，其特征在于，步骤(1)中，离心提取工艺为：加入Tris-HCl缓冲液，在45～55℃搅拌提取1～2h，将提取液高速冷冻离心，收集上清液a加热至70～80℃保温3～7min，快速冷却至室温后再次高速冷冻离心，收集上清液b，加入无水乙醇，-18～-25℃过夜沉淀；再次高速冷冻离心，取沉淀物加入超纯水充分溶解，再次高速冷冻离心，收集上清液c冷冻干燥后得到口虾蛄金属硫蛋白粗提物。3.根据权利要求2所述的一种从口虾蛄中提取高纯度金属硫蛋白的方法，步骤(1)中，其特征在于，所述Tris-HCl缓冲液的pH为7.5～8.0，浓度为0.02～0.05mol/L；加入量为上清液b体积的3倍。4.根据权利要求2所述的一种从口虾蛄中提取高纯度金属硫蛋白的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述口虾蛄与Tris-HCl缓冲液的料液比(3～6)：1g/mL。5.根据权利要求2所述的一种从口虾蛄中提取高纯度金属硫蛋白的方法，其特征在于，步骤(1)中，高速冷冻离心的温度控制在4～10℃，转速控制在10000～15000...

【专利技术属性】
技术研发人员：梅光明，严国，张小军，陈思，孟春英，
申请(专利权)人：浙江省海洋水产研究所，
类型：发明
国别省市：浙江,33