实时灵敏生物大分子检测方法及试剂盒制备技术

本发明专利技术提供一种实时灵敏生物大分子检测方法及试剂盒制备，利用柠檬酸修饰Fe3O4纳米粒子，得到表面为柠檬酸修饰Fe3O4纳米粒子；氨基修饰的Fe3O4纳米微粒2g于室温下180r/min搅拌中迅速加入20mL所制备的金纳米粒子溶液中，混合溶液由棕色逐渐变淡，低速搅拌反应12h后，获得金磁微粒Fe3O4@Au，并制备纳米生物传感器；减少了常用生物大分子测定研究中抗体抗原之间的结合的时间，明显缩短了反应过程，提高反应的效率，有效提高了信噪比，实现了实时灵敏快速检测。

Real-time Sensitive Biomacromolecule Detection and Kit Preparation

【技术实现步骤摘要】
实时灵敏生物大分子检测方法及试剂盒制备
本专利技术涉及生物
，更具体地，涉及一种实时灵敏生物大分子检测方法及试剂盒制备。
技术介绍
免疫印迹(Immunoblot)又称蛋白质印迹(Westernblot)，是分离和识别复杂样品中特定蛋白的常用技术，分辨率和实用性能高，特异性强，灵敏度高，应用于蛋白的定性和半定量分析等。但该技术步骤繁琐，耗时长，有机荧光发色团荧光稳定性低，难以长时间成像。不同的发色团需要不同波长的光源激发，使成像复杂化，且不能同时检测多种蛋白。中国专利申请(公开日：2006年6月21日，CN1789425A)，公开了一种可调控分子马达微动力生物传感器，其包含以下部分：(1)旋转马达：F0F1-ATP酶；(2)光能转换装置：光反应中心与复合物(RC)和泛醌；(3)电子转换装置：与光能转换装置为同一体系；(4)信号分子输出装置：由光激发与发射装置和荧光探针组成；(5)能源系统：由水，ATP，ADP，无机磷，和可见光组成；(6)保护层：双层脂膜作位内膜的保护层；(7)支架材料和双层脂膜的固定材料。该专利公开了荧光探针可以是位于膜外侧的Lipids-荧光素，位于膜内侧的荧光素，分子马达旋转是由ATP水解驱动的，其中所述分子马达旋转是由能转换的跨膜电化学电位差驱动的，或者所述跨膜电化学电位差是由光能或化学能转换的。在该生物传感器中，负载是连接在生物传感器的分子马达的三个β亚基上。荧光分析法是生命科学研究中十分重要的方法之一,其检测灵敏度很大程度上取决于标记物的发光强度和光化学稳定性。荧光标记的灵敏度很高,选择性好,是目前最常用“标记”手段。然而,目前使用的有机荧光染料由于其不可克服的荧光性能缺陷:激发光谱窄,发射光谱宽且拖尾,易光致漂白及化学稳定性不强、寿命短等,极大地限制了其应用。
技术实现思路
本专利技术提供一种克服上述问题或者至少部分地解决上述问题的一种实时灵敏生物大分子检测方法及试剂盒制备，减少了常用生物大分子测定研究中抗体抗原之间的结合的时间，明显缩短了反应过程，提高反应的效率，有效提高了信噪比，实现了实时灵敏快速检测。根据本专利技术实施例的第一个方面，提供一种纳米生物传感器制备方法，包括：将10g新鲜橘子皮粉碎并浸泡于100mL的去离子水中，再将浸泡液于3600r/min条件下，离心3min，取上清液，此上清液即为原液，冰箱4℃条件下保存；室温条件下，将提前4℃预冷的20mL氯金酸溶液(1％，W/V)置于反应皿中，伴随磁力搅拌器温和搅动；2min后，迅速加入橘皮浸泡工作液5mL，工作液为20％原液，随即观察颜色的变化，即由黄色变为紫色再变为酒红色，当体系颜色出现酒红色时，搅拌速度提升，10min后结束反应，获得金纳米粒子，将反应液置于冰箱4℃条件下保存；利用柠檬酸修饰Fe3O4纳米粒子，得到表面为柠檬酸修饰Fe3O4纳米粒子；取2g合成的Fe3O4纳米微粒超声分散在50mL含有20％乙醇水溶液中，逐滴加入1mLAPTES，室温下搅拌7h反应结束后得到浅棕色带细微颗粒的悬浊液，产物即为氨基化修饰后的Fe3O4纳米微粒；此产物用0.1mol/L的HCl－乙醇溶液磁分离清洗3次，烘干后备用；取上述制备的氨基修饰的Fe3O4纳米微粒2g于室温下180r/min搅拌中迅速加入20mL所制备的金纳米粒子溶液中，混合溶液由棕色逐渐变淡，低速搅拌反应12h后，获得金磁微粒Fe3O4@Au；取金磁微粒，用偶联缓冲液平衡3次，将生物分子按20～500μg/mg金磁微粒的比例加入经平衡处理的金磁微粒中，置于20～40℃、180r/min的空气恒温振荡器中充分反应16h；反应完毕，在磁性分离器上分离2～3min，弃上清，用清洗缓冲液清洗，去除非特异性结合的分子；封闭：加入500μL～2mL的封闭剂到表面已固定生物分子的金磁微粒中，置于20～40℃、180r/min的空气恒温振荡器中充分混匀20min～12h进行封闭，得到纳米生物传感器。可选的，利用柠檬酸修饰Fe3O4纳米粒子，得到表面为柠檬酸修饰Fe3O4纳米粒子，具体包括：将以共沉淀合成方法制备得到的Fe3O4纳米粒子水相悬浮液加入反应器中，搅拌并通氮气后，加入柠檬酸水溶液，并在60℃的温度下反应；反应后冷却至室温，磁性分离，洗涤后，重新分散在超纯水中，作为磁性纳米粒子储备液。可选的，柠檬酸溶液的浓度为0.05g/ml～0.15g/ml，Fe3O4纳米粒子浓度为0.006g/ml～0.02g/ml；Fe3O4纳米粒子与柠檬酸溶液的体积比为15:1～10:1；反应温度在65～75℃之间，反应保持10～15min。根据本专利技术实施例的第二个方面，提供一种如本专利技术实施例第一方面所述方法制备的纳米生物传感器。根据本专利技术实施例的第三个方面，提供一种试剂盒，包括如本专利技术实施例第二方面所述的纳米生物传感器。根据本专利技术实施例的第四个方面，提供一种实时灵敏生物大分子检测方法，包括：将固定好生物分子且已封闭的金磁微粒和待测溶液加入到偶联缓冲液中，置于20～40℃、180r/min的空气恒温振荡器中充分反应10min～12h；反应完毕，在磁性分离器上分离2～3min，用清洗缓冲液清洗，去除非特异性结合的分子，并将金磁微粒复合物保存在保存缓冲液中；根据反应结果确定待测溶液是否含有待检测的目标分子。本专利技术提出一种实时灵敏生物大分子检测方法及试剂盒制备，减少了常用生物大分子测定研究中抗体抗原之间的结合的时间，明显缩短了反应过程，提高反应的效率，有效提高了信噪比，实现了实时灵敏快速检测。具体实施方式下面结合实施例，对本专利技术的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本专利技术，但不用来限制本专利技术的范围。一种纳米生物传感器制备方法，其特征在于，包括：将10g新鲜橘子皮粉碎并浸泡于100mL的去离子水中，再将浸泡液于3600r/min条件下，离心3min，取上清液，此上清液即为原液，冰箱4℃条件下保存；室温条件下，将提前4℃预冷的20mL氯金酸溶液(1％，W/V)置于反应皿中，伴随磁力搅拌器温和搅动；2min后，迅速加入橘皮浸泡工作液5mL，工作液为20％原液，随即观察颜色的变化，即由黄色变为紫色再变为酒红色，当体系颜色出现酒红色时，搅拌速度提升，10min后结束反应，获得金纳米粒子，将反应液置于冰箱4℃条件下保存；利用柠檬酸修饰Fe3O4纳米粒子，得到表面为柠檬酸修饰Fe3O4纳米粒子；取2g合成的Fe3O4纳米微粒超声分散在50mL含有20％乙醇水溶液中，逐滴加入1mLAPTES，室温下搅拌7h反应结束后得到浅棕色带细微颗粒的悬浊液，产物即为氨基化修饰后的Fe3O4纳米微粒；此产物用0.1mol/L的HCl－乙醇溶液磁分离清洗3次，烘干后备用；取上述制备的氨基修饰的Fe3O4纳米微粒2g于室温下180r/min搅拌中迅速加入20mL所制备的金纳米粒子溶液中，混合溶液由棕色逐渐变淡，低速搅拌反应12h后，获得金磁微粒Fe3O4@Au；取金磁微粒，用偶联缓冲液平衡3次，将生物分子按20～500μg/mg金磁微粒的比例加入经平衡处理的金磁微粒中，置于20～40℃、180r/min的空气恒温振荡器中充分反应16h；反应完毕，在磁性分离器上分离2～3min，弃上清，用清洗缓冲液清洗，去除非本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种纳米生物传感器制备方法，其特征在于，包括：将10g新鲜橘子皮粉碎并浸泡于100mL的去离子水中，再将浸泡液于3600r/min条件下，离心3min，取上清液，此上清液即为原液，冰箱4℃条件下保存；室温条件下，将提前4℃预冷的20mL氯金酸溶液(1％，W/V)置于反应皿中，伴随磁力搅拌器温和搅动；2min后，迅速加入橘皮浸泡工作液5mL，工作液为20％原液，随即观察颜色的变化，即由黄色变为紫色再变为酒红色，当体系颜色出现酒红色时，搅拌速度提升，10min后结束反应，获得金纳米粒子，将反应液置于冰箱4℃条件下保存；利用柠檬酸修饰Fe3O4纳米粒子，得到表面为柠檬酸修饰Fe3O4纳米粒子；取2g合成的Fe3O4纳米微粒超声分散在50mL含有20％乙醇水溶液中，逐滴加入1mLAPTES，室温下搅拌7h反应结束后得到浅棕色带细微颗粒的悬浊液，产物即为氨基化修饰后的Fe3O4纳米微粒；此产物用0.1mol/L的HCl－乙醇溶液磁分离清洗3次，烘干后备用；取上述制备的氨基修饰的Fe3O4纳米微粒2g于室温下180r/min搅拌中迅速加入20mL所制备的金纳米粒子溶液中，混合溶液由棕色逐渐变淡，低速搅拌反应12h后，获得金磁微粒Fe3O4@Au；取金磁微粒，用偶联缓冲液平衡3次，将生物分子按20～500μg/mg金磁微粒的比例加入经平衡处理的金磁微粒中，置于20～40℃、180r/min的空气恒温振荡器中充分反应16h；反应完毕，在磁性分离器上分离2～3min，弃上清，用清洗缓冲液清洗，去除非特异性结合的分子；封闭：加入500μL～2mL的封闭剂到表面已固定生物分子的金磁微粒中，置于20～40℃、180r/min的空气恒温振荡器中充分混匀20min～12h进行封闭，得到纳米生物传感器。...

【技术特征摘要】
1.一种纳米生物传感器制备方法，其特征在于，包括：将10g新鲜橘子皮粉碎并浸泡于100mL的去离子水中，再将浸泡液于3600r/min条件下，离心3min，取上清液，此上清液即为原液，冰箱4℃条件下保存；室温条件下，将提前4℃预冷的20mL氯金酸溶液(1％，W/V)置于反应皿中，伴随磁力搅拌器温和搅动；2min后，迅速加入橘皮浸泡工作液5mL，工作液为20％原液，随即观察颜色的变化，即由黄色变为紫色再变为酒红色，当体系颜色出现酒红色时，搅拌速度提升，10min后结束反应，获得金纳米粒子，将反应液置于冰箱4℃条件下保存；利用柠檬酸修饰Fe3O4纳米粒子，得到表面为柠檬酸修饰Fe3O4纳米粒子；取2g合成的Fe3O4纳米微粒超声分散在50mL含有20％乙醇水溶液中，逐滴加入1mLAPTES，室温下搅拌7h反应结束后得到浅棕色带细微颗粒的悬浊液，产物即为氨基化修饰后的Fe3O4纳米微粒；此产物用0.1mol/L的HCl－乙醇溶液磁分离清洗3次，烘干后备用；取上述制备的氨基修饰的Fe3O4纳米微粒2g于室温下180r/min搅拌中迅速加入20mL所制备的金纳米粒子溶液中，混合溶液由棕色逐渐变淡，低速搅拌反应12h后，获得金磁微粒Fe3O4@Au；取金磁微粒，用偶联缓冲液平衡3次，将生物分子按20～500μg/mg金磁微粒的比例加入经平衡处理的金磁微粒中，置于20～40℃、180r/min的空气恒温振荡器中充分反应16h；反应完毕，在磁性分离器上分离2～3min，弃上清，用清洗缓冲液清洗，去除非特异性结合的分...

【专利技术属性】
技术研发人员：冷毅斌，吴娟，寇小娟，
申请(专利权)人：武汉巴菲尔生物技术服务有限公司，
类型：发明
国别省市：湖北,42