共光轴度和放大倍数可自校准的荧光颗粒示踪方法与装置制造方法及图纸

共光轴度和放大倍数可自校准的荧光颗粒示踪方法与装置属于荧光颗粒超分辨显微测量领域，本发明专利技术的测量系统中双光斑光束向量测量单元首先确定输出光束的方向向量，该输出光束透射所有测量组成部分的姿态平面镜块，在已知姿态平面镜块条件下，通过折射定理，可得姿态平面镜块的偏摆和俯仰姿态角，回位补偿偏摆和俯仰姿态角，便实现了显微光路共光轴姿态，另外，因该输出光束入射进显微成像光路中，其放大后的平移量可由测量系统获得，而实际平移量可由双光斑光束向量测量单元获得，由此可确定测量系统的放大倍数，该具有共光轴度和放大倍数自校准功能的测量系统为保证荧光单颗粒示踪的测量准确性提供必要技术手段。

Self-calibrated fluorescent particle tracing method and device for common optical axis and magnification

【技术实现步骤摘要】
共光轴度和放大倍数可自校准的荧光颗粒示踪方法与装置
本专利技术属于荧光颗粒超分辨显微测量领域，主要涉及一种实现荧光颗粒探针轨迹准确示踪的方法与装置。
技术介绍
荧光单颗粒示踪是一种通过显微技术实时测量观察颗粒探针运动轨迹的方法，它是荧光超分辨技术中的一个重要的分支。当显微镜的物镜视野下仅有荧光单颗粒的时候，通过拟合算法，此荧光单颗粒位置精度可很容易地超过光学分辨率极限——瑞利限度，达到纳米量级。荧光单颗粒示踪所获得的数据为颗粒探针的运动位移轨迹，该轨迹体现了微环境的力学特性，将探针轨迹转换为平均平方位移，可以实时获取被测介质的时间依赖性黏弹性模量和蠕变柔量等参数。因此，荧光单颗粒示踪成为了生物学领域、生物力学领域以及流变学中一种非常重要的显微测量方法。单颗粒示踪方法在诞生之初只是获取样品中颗粒探针的平面二维位移或三维位移投影在二维平面上的轨迹信息，欠缺颗粒探针在纵轴方向上的位移信息，无法实现颗粒探针轨迹的真正完整分析。在所有荧光单颗粒的三维示踪方法中，从光学系统实现难易程度以及荧光颗粒轨迹测量准确性角度综合考虑，基于像散成像的荧光单颗粒示踪是一种具有较为良好整体性能的荧光单颗粒的三维示踪方法。在使用一般显微放大镜实现单颗粒示踪时，根据离焦弥散效应，探针颗粒成像光斑离焦程度越大，光斑弥散半径越大，根据此效应通过建立成像光斑弥散半径与颗粒探针纵向位置的函数关系，实现颗粒探针包含纵向位移测量的三维轨迹示踪。但是该方法的纵向位移测量误差较大，特别是在焦点附近的纵向位移测量误差较大。为此，研究人员在物镜后面间加上一个散光的柱面透镜（见SCI期刊：TrackingofSingleFluorescentParticlesinThreeDimensions:UseofCylindricalOpticstoEncodeParticlePosition[J],BiophysicalJournal,1994,67:1291–1300;Nanometricthree-dimensionaltrackingofindividualquantumdotsincells[J],AppliedPhysicsLetters,2007,90(5):053902-053902-3），通过像散原理，使光斑椭圆化，增大纵向位移时光斑变化的差异性，改善纵向位移测量误差，从而实现了基于像散成像的荧光单颗粒示踪方法。对于基于像散成像的荧光单颗粒示踪，因为所要测量的样品不同，所以需要选用不同种类或粒径的荧光颗粒探针，为实现荧光颗粒准确示踪，因此需要根据所选用荧光颗粒确定不同的显微放大倍数以达到所选用荧光颗粒最佳显微成像的目的；除了放大倍数因素影响荧光颗粒准确示踪外，另一个影响荧光单颗粒准确示踪的因素是显微成像元件的共光轴度，只有保证显微成像光学元件的共光轴才能得到准确的光斑成像，从而实现荧光颗粒的准确示踪。
技术实现思路
针对上述基于像散成像的荧光单颗粒示踪中显微放大倍数如何确定和显微成像光学元件共光轴度如何实现的问题，本专利技术提出和研发具有共光轴度和放大倍数可自校准功能的像散成像式荧光单颗粒变倍示踪方法与装置，该专利技术实现了像散成像的荧光单颗粒示踪中显微放大倍数和显微成像光学元件共光轴度的确定和校准。本专利技术的目的通过以下技术方案实现：一种共光轴度和放大倍数可自校准的荧光颗粒示踪方法，该方法步骤如下：（1）激光扩束器将光纤准直头出射的输出光束调节为一极细光束，并且使该输出光束不与任何元件发生光学作用，直接入射进双光斑光束向量测量单元中，通过该输出光束在双光斑光束向量测量单元中两个光斑位置探测器上被检测得到的光斑，得到输出光束在双光斑光束向量测量单元所决定坐标系中的方向向量(见SCI期刊：Compensationoferrorsduetoincidentbeamdriftina3DOFmeasurementsystemforlinearguidemotion.OpticsExpress,2015,23(22):28389-28401;Parametercorrectionmethodfordualpositionsensitivedetectorbasedunit.AppliedOptics,2016,55(15):4073-4078.)；（2）在显微光路纵向位移平台上纵向移动CCD水平位移台到达某纵向位置后，再在CCD水平位移台上水平位移CCD姿态调节架，使输出光束透射CCD姿态平面镜块，因为CCD姿态平面镜块的平面法线与的感光接收面法线平行，所以，如果输出光束与CCD姿态平面镜块的平面法线不平行，即如果输出光束与CCD的感光接收面不垂直，输出光束将发生平移变化，即输出光束在双光斑光束向量测量单元中两个光斑位置探测器上被检测得到的光斑发生平移变化ΔCCD，在已知CCD姿态平面镜块厚度dCCD条件下，根据光束经平面镜块透射后入射光束与出射光束的空间平移关系，可得输出光束与CCD姿态平面镜块平面法线俯仰夹角或偏摆夹角θCCD与ΔCCD的关系式为ΔCCD=sin(θCCD–θ)×(dCCD/cosθ)，其中，na和n分别为空气折射率和平面镜块折射率，θ为θCCD对应的折射角，再根据折射率公式sinθCCD×na=sinθ×n，得关于sinθCCD一元三次方程2×dCCD×ΔCCD×na2×sin3θCCD+sin2θCCD×(d2CCD×n2-na2×Δ2CCD-d2CCD×na2)-2×dCCD×θCCD×n2×sinθCCD+Δ2CCD×n2=0，解此方程，并通过θCCD为锐角这一条件舍去不符合实际的方程解后从而得到θCCD值，根据θCCD值用CCD姿态调节架调节CCD姿态，回位产生的光斑平移量ΔCCD，即使输出光束与CCD的感光接收面垂直；（3）在显微光路纵向位移平台上纵向移动柱面透镜水平位移台到达CCD下方某位置处，再在柱面透镜水平位移台上水平位移柱面透镜姿态调节架，使透射过CCD姿态平面镜块的输出光束透射柱面透镜姿态平面镜块，如果输出光束不与柱面透镜姿态平面镜块垂直，输出光束在双光斑光束向量测量单元中测量得到的光斑平移量为Δ柱面，根据折射率公式，在已知柱面透镜姿态平面镜块厚度d柱面条件下，将步骤（2）的一元三次方程中ΔCCD替换为Δ柱面，dCCD替换为d柱面，θCCD替换为输出光束相对柱面透镜姿态平面镜块平面法线俯仰夹角或偏摆夹角θ柱面，然后对其求解θ柱面值，根据θ柱面值用柱面透镜姿态调节架调节柱面透镜姿态，回位光斑平移量Δ柱面，使输出光束与柱面透镜姿态平面镜块垂直，即使输出光束与柱面透镜底部平面垂直；（4）在显微物镜水平位移台上水平平移显微物镜姿态调节架，使显微物镜处于柱面透镜下方，并使透射过柱面透镜姿态平面镜块的输出光束透射显微物镜姿态平面镜块，如果输出光束不与显微物镜姿态平面镜块垂直，输出光束在双光斑光束向量测量单元中测量得到的光斑平移量为Δ物镜，根据折射率公式，在已知显微物镜姿态平面镜块厚度d物镜条件下，将步骤（2）的一元三次方程中ΔCCD替换为Δ物镜，dCCD替换为d物镜，θCCD替换为输出光束相对显微物镜姿态平面镜块平面法线俯仰夹角或偏摆夹角θ物镜，然后对其求解θ物镜值，根据θ物镜值用显微物镜姿态调节架调节显微物镜姿态，回位产生的光本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种共光轴度和放大倍数可自校准的荧光颗粒示踪方法，其特征在于该方法步骤如下： （1）激光扩束器将光纤准直头出射的输出光束调节为一极细光束，并且使该输出光束不与任何元件发生光学作用，直接入射进双光斑光束向量测量单元中，通过该输出光束在双光斑光束向量测量单元中两个光斑位置探测器上被检测得到的光斑，得到输出光束在双光斑光束向量测量单元所决定坐标系中的方向向量；（2）在显微光路纵向位移平台上纵向移动CCD水平位移台到达某纵向位置后，再在CCD水平位移台上水平位移CCD姿态调节架，使输出光束透射CCD姿态平面镜块，因为CCD姿态平面镜块的平面法线与的感光接收面法线平行，所以，如果输出光束与CCD姿态平面镜块的平面法线不平行，即如果输出光束与CCD的感光接收面不垂直，输出光束将发生平移变化，即输出光束在双光斑光束向量测量单元中两个光斑位置探测器上被检测得到的光斑发生平移变化ΔCCD，在已知CCD姿态平面镜块厚度dCCD条件下，根据光束经平面镜块透射后入射光束与出射光束的空间平移关系，可得输出光束与CCD姿态平面镜块平面法线俯仰夹角或偏摆夹角θCCD与ΔCCD的关系式为ΔCCD = sin(θCCD – θ) ×( dCCD/ cosθ)，其中，na和n分别为空气折射率和平面镜块折射率，θ为θCCD对应的折射角，再根据折射率公式sinθCCD×na = sinθ×n ，得关于sinθCCD一元三次方程2×dCCD×ΔCCD× na...

【技术特征摘要】
1.一种共光轴度和放大倍数可自校准的荧光颗粒示踪方法，其特征在于该方法步骤如下：（1）激光扩束器将光纤准直头出射的输出光束调节为一极细光束，并且使该输出光束不与任何元件发生光学作用，直接入射进双光斑光束向量测量单元中，通过该输出光束在双光斑光束向量测量单元中两个光斑位置探测器上被检测得到的光斑，得到输出光束在双光斑光束向量测量单元所决定坐标系中的方向向量；（2）在显微光路纵向位移平台上纵向移动CCD水平位移台到达某纵向位置后，再在CCD水平位移台上水平位移CCD姿态调节架，使输出光束透射CCD姿态平面镜块，因为CCD姿态平面镜块的平面法线与的感光接收面法线平行，所以，如果输出光束与CCD姿态平面镜块的平面法线不平行，即如果输出光束与CCD的感光接收面不垂直，输出光束将发生平移变化，即输出光束在双光斑光束向量测量单元中两个光斑位置探测器上被检测得到的光斑发生平移变化ΔCCD，在已知CCD姿态平面镜块厚度dCCD条件下，根据光束经平面镜块透射后入射光束与出射光束的空间平移关系，可得输出光束与CCD姿态平面镜块平面法线俯仰夹角或偏摆夹角θCCD与ΔCCD的关系式为ΔCCD=sin(θCCD–θ)×(dCCD/cosθ)，其中，na和n分别为空气折射率和平面镜块折射率，θ为θCCD对应的折射角，再根据折射率公式sinθCCD×na=sinθ×n，得关于sinθCCD一元三次方程2×dCCD×ΔCCD×na2×sin3θCCD+sin2θCCD×(d2CCD×n2-na2×Δ2CCD-d2CCD×na2)-2×dCCD×θCCD×n2×sinθCCD+Δ2CCD×n2=0，解此方程，并通过θCCD为锐角这一条件舍去不符合实际的方程解后从而得到θCCD值，根据θCCD值用CCD姿态调节架调节CCD姿态，回位产生的光斑平移量ΔCCD，即使输出光束与CCD的感光接收面垂直；（3）在显微光路纵向位移平台上纵向移动柱面透镜水平位移台到达CCD下方某位置处，再在柱面透镜水平位移台上水平位移柱面透镜姿态调节架，使透射过CCD姿态平面镜块的输出光束透射柱面透镜姿态平面镜块，如果输出光束不与柱面透镜姿态平面镜块垂直，输出光束在双光斑光束向量测量单元中测量得到的光斑平移量为Δ柱面，根据折射率公式，在已知柱面透镜姿态平面镜块厚度d柱面条件下，将步骤（2）的一元三次方程中ΔCCD替换为Δ柱面，dCCD替换为d柱面，θCCD替换为输出光束相对柱面透镜姿态平面镜块平面法线俯仰夹角或偏摆夹角θ柱面，然后对其求解θ柱面值，根据θ柱面值用柱面透镜姿态调节架调节柱面透镜姿态，回位光斑平移量Δ柱面，使输出光束与柱面透镜姿态平面镜块垂直，即使输出光束与柱面透镜底部平面垂直；（4）在显微物镜水平位移台上水平平移显微物镜姿态调节架，使显微物镜处于柱面透镜下方，并使透射过柱面透镜姿态平面镜块的输出光束透射显微物镜姿态平面镜块，如果输出光束不与显微物镜姿态平面镜块垂直，输出光束在双光斑光束向量测量单元中测量得到的光斑平移量为Δ物镜，根据折射率公式，在已知显微物镜姿态平面镜块厚度d物镜条件下，将步骤（2）的一元三次方程中ΔCCD替换为Δ物镜，dCCD替换为d物镜，θCCD替换为输出光束相对显微物镜姿态平面镜块平面法线俯仰夹角或偏摆夹角θ物镜，然后对其求解θ物镜值，根据θ物镜值用显微物镜姿态调节架调节显微物镜姿态，回位产生的光斑平移量Δ物镜，使输出光束与显微物镜姿态平面镜块垂直，即使输出光束与显微物镜的光轴平行；（5）通过六维精密位移台平移载物板，使其处于显微物镜下方，并使透射过显微物镜姿态平面镜块的输出光束透射载物板姿态平面镜块，如果输出光束不与载物板姿态平面镜块垂直，输出光束在双光斑光束向量测量单元中测量得到的光斑平移量为Δ载物，根据折射率公式，在已知载物板姿态平面镜块厚度d载物条件下，将步骤（2）的一元三次方程中ΔCCD替换为Δ载物，dCCD替换为d载物，θCCD替换为输出光束相对载物板姿态平面镜块平面法线俯仰夹角或偏摆夹角θ载物，然后对其求解θ载物值，根据θ载物值用六维精密位移台调节载物板姿态，回位产生的光斑平移量Δ载物，使输出光束与载物板姿态平面镜块垂直，即使输出光束与载物板平面法线平行；（6）通过六维精密位移台使载物板姿态平面镜块绕其Y坐标轴偏摆微小角度α和绕其X坐标轴俯仰微小角度β，分别使输出光束产生方向向量不变的空间平移，输出光束在双光斑光束向量测量单元中分...

【专利技术属性】
技术研发人员：毛帅，
申请(专利权)人：山东理工大学，
类型：发明
国别省市：山东,37