一种检测细胞活性的荧光碳点、制备方法及其应用技术

本发明专利技术提供了一种检测细胞活性的荧光碳点、制备方法及其应用，将2，4‑二羟基苯甲醛和1，2，3，3‑四甲基‑3H‑碘化吲哚溶解在无水乙醇中，微波反应1h，冷却后用滤膜纯化，旋转蒸发得到深红色的碳点固体，溶解在DMSO中作为储备液。本发明专利技术碳点合成十分简单，便于操作；本发明专利技术能检测细胞活性；本发明专利技术可以通过高灵敏监测线粒体的膜电位，以区分健康、凋亡和死细胞。

A Fluorescent Carbon Spot for Detecting Cell Activity, Its Preparation Method and Application

【技术实现步骤摘要】
一种检测细胞活性的荧光碳点、制备方法及其应用
本专利技术涉及于荧光碳点和生物传感
，具体涉及一种检测细胞活性的荧光碳点、制备方法及其应用。
技术介绍
线粒体是细胞的发电站，在许多重要的生物过程中起着关键作用。线粒体损伤和功能障碍与一系列疾病，比如：癌症、糖尿病、阿尔茨海默病和帕金森病、心肌缺血再灌注损伤和衰老退行性疾病等密切相关。线粒体膜电位的减少和消失代表线粒体损伤和细胞死亡。因此，监测线粒体膜电位变化的方法非常重要。碳点由于低毒性，良好的生物相容性，优异的光稳定性，易于表面改性和低成本的优点，已经广泛应用于生物成像。到目前为止，虽然有一些报道的碳点可以感知到线粒体膜电位的降低，但没有可以敏感地、选择性地显示线粒体膜电位的三种不同水平，即正常，减少和消失，以及它们在线粒体相关生物过程中的应用。因此本专利技术拟在解决这样的难题，通过碳点在不同健康状态中细胞器的靶向情况，用来检测线粒体膜电位，以反映细胞活力，区分健康、凋亡和死细胞。
技术实现思路
本专利技术提出了一种检测细胞活性的荧光碳点、制备方法及其应用，苯甲醛衍生物可以生成碳点，1，2，3，3-四甲基-3H-吲哚具有靶向线粒体的能力，利用两者缩合来合成碳点，能够高效灵敏地监测线粒体的膜电位，同时通过在不同细胞器中的定位，实现区分健康细胞、凋亡细胞和死细胞。实现本专利技术的技术方案是：一种检测细胞活性的荧光碳点的制备方法，将2，4-二羟基苯甲醛和1，2，3，3-四甲基-3H-碘化吲哚溶解在无水乙醇中，微波反应1h，冷却后用滤膜纯化，旋转蒸发得到深红色的碳点固体，溶解在DMSO中作为储备液。基于检测细胞活性的荧光碳点合成路线如下：所述2，4-二羟基苯甲醛和1，2，3，3-四甲基-3H-碘化吲哚的摩尔比为3:1。所述微波反应温度为130℃，冷却后用0.22μM的滤膜纯化。所述荧光碳点通过在不同细胞器中的定位实现监测线粒体膜电位，区分健康、凋亡和死细胞。上述应用具体包括：分别测试碳点在不同健康状态中细胞器的靶向情况，监测线粒体膜电位，以反映细胞活力，区分健康、凋亡和死细胞。在生物医学研究和相关疾病的诊断中有很好的前景。本专利技术的有益效果是：(1)碳点合成十分简单，便于操作；(2)本专利技术能检测细胞活性；(3)本专利技术可以通过高灵敏监测线粒体的膜电位，以区分健康、凋亡和死细胞。附图说明为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本专利技术的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。图1为实施例1碳点的TEM图谱。图2是实施例1碳点的IR图谱。图3是实施例1碳点的XPS图谱。图4是实施例1碳点(5μgmL-1)在PBS(10mMpH＝7.4)中的紫外和荧光光谱图。图5是实施例1碳点的荧光寿命图谱。图6是实施例1碳点的光稳定性图谱。图7是在PBS缓冲(10mM，pH＝7.4)体系中，5μg/mL碳点分别与200μM不同的氨基酸、200μM不同的ROS、1mM阴、阳离子，反应后于546nm处的荧光强度随时间的变化的荧光光谱图。图8是实施例1碳点在健康细胞和死细胞中的共定位图。(A)是健康细胞，先孵育碳点30分钟，在孵育商业线粒体染料30分钟后成像；(B)是死细胞，用4％的多聚甲醛固定细胞30min，再孵育碳点30分钟，孵育商业细胞核染料30分钟后成像。图9是实施例1碳点在凋亡细胞中的共定位图。(A)组是先孵育碳点和商业溶酶体探针，在加入CCCP(20μM)凋亡；(B)组是先孵育碳点和商业溶酶体探针，在加入H2O2(8mM)凋亡；(C)组是先孵育碳点和商业溶酶体探针，再加入HBSS凋亡。具体实施方式下面将结合本专利技术实施例，对本专利技术的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有付出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。实施例1碳点的合成，步骤如下：将2，4-二羟基苯甲醛和1，2，3，3-四甲基-3H-碘化吲哚以摩尔比为3：1的比例溶解在无水乙醇中，130℃微波反应1小时，冷却后用0.22μM的滤膜纯化，旋转蒸发得到深红色的碳点固体，溶解在DMSO中作为储备液。图1为碳点的TEM图谱，近似球形的结构，粒径统计大小为1.7nm，对应0.23nm的晶格，说明已经形成了碳点。图2是碳点的IR图谱，3428.11cm-1对应于-OH的伸缩振动，3156.79cm-1对应于-N-H的伸缩振动，1620.50，1578.45，1503.36，1477.81cm-1对应于芳香氢，1620.50cm-1对应于C＝C/C＝N的伸缩振动，1316.79cm-1对应于C-N的伸缩振动，1263.19cm-1对应于C-O的伸缩振动，854.33，705.97cm-1对应于C-H，-OH的弯曲振动。说明两种原料已经结合在一起，生成了碳点。图3是碳点的XPS图谱，284.8，400.92和532.36eV，分别对应于C1s，N1s和O1s，它们的原子百分比分别为77.02％，1.09％和21.89％，进一步说明了碳点的生成。图4是碳点(5μgmL-1)在PBS(10mMpH＝7.4)中的紫外和荧光光谱图，其中最大的吸收和发射分别是525nm和546nm。图5是碳点在PBS(10mMpH＝7.4)中，546nm处的荧光寿命图谱，荧光寿命为1.0337ns。图6是碳点在PBS(10mMpH＝7.4)中的光稳定性图谱，在250W氙灯下连续照射30min，碳点的荧光强度并没有发生明显的变化，说明碳点可以抗光漂白，适合用于生物成像。实施例25μg/mL碳点与200μM不同的氨基酸、200μM不同的ROS、1mM阴阳离子的反应2mL的含有5μg/mL碳点的PBS缓冲(10mM，pH＝7.4)体系中，分别加入20μL20mM的分析物：1：碳点；2：苏氨酸；3：精氨酸；4：甲硫氨酸；5：脯氨酸；6：甘氨酸；7：赖氨酸；8：亮氨酸；9：色氨酸；10：异亮氨酸；11：丙氨酸；12：组氨酸；13：谷氨酸；14：天冬氨酸；15：缬氨酸；16：丝氨酸；17：半胱氨酸；18：高半胱氨酸；19：谷胱甘肽；20：H2O2；21：NaNO2；22：t-BuOOH；23：.OH；24：KCl；25：CaCl2；26：NaCl；27：MgCl2；28：AlCl3；29：ZnSO4；30：FeCl3；31：FeCl2；32：CuSO4；33：NiCl2；34：CrCl3；35：K2CrO7；36：MnCl2；37：NaF；38：NaCl；39：NaBr；40：KI；41：Na2SO4；42：Mg(NO3)2进行荧光光谱测定。同时对不同分析物在546nm处的荧光强度进行比较。图7实验数据表明碳点与这些分析物没有反应。实施例3碳点在不同健康状态细胞里的共定位健康细胞：在1mL的细胞培养基中加入碳点(10μg/mL)，培养30min，用PBS洗涤三次，加入商业线粒体探针MitoTrackerDeepRed(100nM)培养30min，用PBS洗涤三次，在共聚焦显微镜中可观本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种检测细胞活性的荧光碳点的制备方法，其特征在于：将2，4‑二羟基苯甲醛和1，2，3，3‑四甲基‑3H‑碘化吲哚溶解在无水乙醇中，微波反应1h，冷却后用滤膜纯化，旋转蒸发得到深红色的碳点固体。

【技术特征摘要】
1.一种检测细胞活性的荧光碳点的制备方法，其特征在于：将2，4-二羟基苯甲醛和1，2，3，3-四甲基-3H-碘化吲哚溶解在无水乙醇中，微波反应1h，冷却后用滤膜纯化，旋转蒸发得到深红色的碳点固体。2.根据权利要求1所述的检测细胞活性的荧光碳点的制备方法，其特征在于：所述2，4-二羟基苯甲醛和1，2，3，3-四甲基-3H-碘化吲哚的摩尔比为3:1。3.根据...

【专利技术属性】
技术研发人员：李朝辉，屈凌波，尹晓慧，孙远强，杨冉，
申请(专利权)人：郑州大学，
类型：发明
国别省市：河南,41