一种基于LAMP技术的安卡拉病毒快速检测方法及引物组合物技术

本发明专利技术公开了一种基于LAMP技术的安卡拉病毒快速检测方法及引物组合物。该方法包括以下步骤：(1)分别设计内引物、外引物和环引物，具体序列如SEQ ID NO.1～6所示；(2)提取病毒DNA备用；(3)建立反应体系；(4)将步骤(3)建立的反应体系置于60～70℃的恒温体系中反应60～80min，然后再在80～90℃反应5～10min即可。本发明专利技术提供的检测方法特异性强，灵敏度高，经济实惠，操作简单，适用于基层检测，能满足基层检测的需求。

A Rapid Detection Method and Primer Composition of Ankara Virus Based on LAMP Technology

【技术实现步骤摘要】
一种基于LAMP技术的安卡拉病毒快速检测方法及引物组合物
本专利技术属于基因工程
，具体涉及一种基于LAMP技术的安卡拉病毒快速检测方法及引物组合物。
技术介绍
I群禽腺病毒(FowlAdenovirus)血清4型(FADV-4)又称为安卡拉病毒，主要引起鸡的心包积水-肝炎综合征，是一种新型鸡传染病。可导致家禽尤其是肉鸡心包积水，免疫力下降，易继发新城疫、大肠杆菌病等疫病，是一种高死亡率的疫病。近年安卡拉病毒病的流行对家禽养殖业造成较大威胁，最早2013年有发病报道，2014至2015年该病先在河南、山东等地流行而后在全国大范围流行。易感品种也由2014年发现的“三黄种鸡”、“麻鸡”等品种发展到现在的包括大部分商品蛋鸡、肉鸡在内品种。该病毒可经粪便、气管等分泌物水平传播，也可经精液、种蛋垂直传播，也可通过空气进行长时间的缓慢传播，现在已经有人通过琼脂扩散试验、PCR检测、酶联免疫吸附试验等方法对FADV-4进行检测。PCR检测法和ELISA检测法等传统检测方法准确性高，但该方法操作耗时，仪器要求较高，繁琐，易出现假阳性。
技术实现思路
针对现有技术中的上述不足，本专利技术提供一种基于LAMP技术的安卡拉病毒快速检测方法及引物组合物，本专利技术提供的检测方法特异性强，灵敏度高，经济实惠，操作简单，适用于基层检测，能满足基层检测的需求。为实现上述目的，本专利技术解决其技术问题所采用的技术方案是：一种基于LAMP技术的安卡拉病毒快速检测方法，包括以下步骤：(1)分别设计内引物、外引物和环引物，具体序列如下：外引物：F3:5’-ACAAGTTCAGACAGACGGTC-3’；(SEQIDNO.1)B3:5’-GCAGTAGGGCTTGAAGGAC-3’；(SEQIDNO.2)内引物：FIP:5’-GTCGTCGGTTTGGATGGGGTAA-ATGTCACGACAGAAAAGGCT-3’；(SEQIDNO.3)BIP:5’-ACAACATCAATGTGGGCGACGG-TCGGTCTAGGATTCCCTTGA-3’；(SEQIDNO.4)环引物：LF:5’-GCGGATTTGCAGCCGTT-3’；(SEQIDNO.5)LB:5’-ACGCCGGAAATCTTCGTCACC-3’；(SEQIDNO.6)(2)提取安卡拉病毒DNA备用；(3)建立反应体系，其具体包括：4～14mMMgSO4、1～3mMdNTPmix、1～2μM内引物、0.1～0.5μM外引物、0.1～1μM环引物、300～400U/mLBst3.0DNA聚合酶、2.5～5μL10×Thermopolreactionbuffer、120～150μmol/L金属离子指示剂、1～3μL安卡拉病毒DNA模板，最后用ddH2O补足至25～50μL；(4)将步骤(3)建立的反应体系置于60～70℃的恒温体系中反应60～80min，然后再在80～90℃反应5～10min即可。进一步地，步骤(3)中反应体系包括：6mMMgSO4、1.4mMdNTPmix、1.6μM内引物、0.2μM外引物、0.4μM环引物、320U/mLBst3.0DNA聚合酶、2.5μL10×Thermopolreactionbuffer、120μmol/L金属离子指示剂、2μL安卡拉病毒DNA模板，最后用ddH2O补足至25μL。进一步地，内引物FIP和BIP加入量均为1.6μM；外引物F3和B3的加入量均为0.2μM；环引物LF和LB的加入量均为0.4μM。进一步地，金属离子指示剂为羟基萘酚蓝。进一步地，10×Thermopolreactionbuffer包括0.1％TritonX-100、20mmol/LTris-HCL、10mmol/LKCL、5mmol/LMgSO4，以及10mmol/L(NH4)2SO4。进一步地，步骤(4)中反应过程为：将步骤(3)建立的反应体系置于65℃的恒温水浴锅中反应60min，然后再在80℃反应5min，去除Bst3.0DNA聚合酶活性即可。用于进行环介导等温扩增检测的引物组合物，该引物组合物包括内引物、外引物和环引物，具体序列如下：外引物：F3:5’-ACAAGTTCAGACAGACGGTC-3’；(SEQIDNO.1)B3:5’-GCAGTAGGGCTTGAAGGAC-3’；(SEQIDNO.2)内引物：FIP:5’-GTCGTCGGTTTGGATGGGGTAA-ATGTCACGACAGAAAAGGCT-3’；(SEQIDNO.3)BIP:5’-ACAACATCAATGTGGGCGACGG-TCGGTCTAGGATTCCCTTGA-3’；(SEQIDNO.4)环引物：LF:5’-GCGGATTTGCAGCCGTT-3’；(SEQIDNO.5)LB:5’-ACGCCGGAAATCTTCGTCACC-3’。(SEQIDNO.6)本专利技术的有益效果为：本专利技术特异性强，灵敏度高，检测结果精确度高，并且，在体系中加入了金属离子指示剂，使得检测过程中的颜色变化肉眼可见，避免了开盖污染，同时，金属离子指示剂(羟基萘酚蓝)价格便宜，经济实惠，能够满足基层检测的需要。附图说明图1为Mg2+浓度优化的电泳图；图2为BstDNA聚合酶用量优化的电泳图；图3为反应温度优化的电泳图；图4为反应时间优化的电泳图；图5为LAMP反应后加入荧光染料的结果图；图6为LAMP-HNB特异性检测结果图；图7为LAMP特异性检测电泳结果图；图8为LAMP敏感性检测电泳结果图；图9为PCR敏感性检测电泳结果图；图10为临床模拟样品PCR检测电泳结果图；图11为临床模拟样品LAMP检测电泳结果图；图12为LAMP反应后加入荧光染料的结果图；图13为临床模拟样品LAMP-HNB检测结果图。具体实施方式下面对本专利技术的具体实施方式进行描述，以便于本
的技术人员理解本专利技术，但应该清楚，本专利技术不限于具体实施方式的范围，对本
的普通技术人员来讲，只要各种变化在所附的权利要求限定和确定的本专利技术的精神和范围内，这些变化是显而易见的，一切利用本专利技术构思的专利技术创造均在保护之列。1、病毒毒株和实验动物Ⅰ群禽腺病毒的4型标准毒株、减蛋综合征病毒(EDSV)、禽包涵体肝炎病毒、新城疫病毒(NDV)、鸡传染性法氏囊病毒(IBDV)、禽呼肠孤病毒(ARV)和禽传染性支气管炎病毒(IBV)均由四川农业大学动物传染病实验室保存。实验用SPF鸡胚购自济南赛斯家禽科技有限公司。2、试剂制备TaKaRaMiniBESTPlasmidPurificationKitVer.4.0购自北京索莱宝科技有限公司，Bst3.0DNAPolymerase购自上海仪涛生物仪器有限公司，引物和质粒购自北京擎科新业生物技术有限公司，羟基萘酚蓝(HNB)购自酷尔化学科技有限公司，DNA病毒基因组提取试剂盒购自宝生物工程(大连)有限公司。实施例1病毒增殖以及病毒DNA的提取采用卵黄囊接种法扩繁安卡拉病毒，先将原病毒液用灭菌生理盐水稀释10倍，每枚鸡胚接种0.4mL已稀释的病毒，接种8枚鸡胚，弃去24h内死亡鸡胚，6-8d后收获病毒尿囊液，-20℃保存。取1.5mL溶解后的病毒尿囊液置于EP管中，然后12000rpm离心2min后吸取上清夜于新的本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于LAMP技术的安卡拉病毒快速检测方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)分别设计内引物、外引物和环引物，具体序列如下：外引物：F3:5’‑ACAAGTTCAGACAGACGGTC‑3’；B3:5’‑GCAGTAGGGCTTGAAGGAC‑3’；内引物：FIP:5’‑GTCGTCGGTTTGGATGGGGTAA‑ATGTCACGACAGAAAAGGCT‑3’；BIP:5’‑ACAACATCAATGTGGGCGACGG‑TCGGTCTAGGATTCCCTTGA‑3’；环引物：LF:5’‑GCGGATTTGCAGCCGTT‑3’；LB:5’‑ACGCCGGAAATCTTCGTCACC‑3’；(2)提取安卡拉病毒DNA备用；(3)建立反应体系，其具体包括：4～14mM MgSO4、1～3mM dNTP mix、1～2μM内引物、0.1～0.5μM外引物、0.1～1μM环引物、300～400U/mL Bst 3.0 DNA聚合酶、2.5～5μL 10×Thermopol reaction buffer、120～150μmol/L金属离子指示剂、1～3μL安卡拉病毒DNA模板，最后用ddH2O补足至25～50μL；(4)将步骤(3)建立的反应体系置于60～70℃的恒温体系中反应60～80min，然后再在80～90℃反应5～10min即可。...

【技术特征摘要】
1.一种基于LAMP技术的安卡拉病毒快速检测方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)分别设计内引物、外引物和环引物，具体序列如下：外引物：F3:5’-ACAAGTTCAGACAGACGGTC-3’；B3:5’-GCAGTAGGGCTTGAAGGAC-3’；内引物：FIP:5’-GTCGTCGGTTTGGATGGGGTAA-ATGTCACGACAGAAAAGGCT-3’；BIP:5’-ACAACATCAATGTGGGCGACGG-TCGGTCTAGGATTCCCTTGA-3’；环引物：LF:5’-GCGGATTTGCAGCCGTT-3’；LB:5’-ACGCCGGAAATCTTCGTCACC-3’；(2)提取安卡拉病毒DNA备用；(3)建立反应体系，其具体包括：4～14mMMgSO4、1～3mMdNTPmix、1～2μM内引物、0.1～0.5μM外引物、0.1～1μM环引物、300～400U/mLBst3.0DNA聚合酶、2.5～5μL10×Thermopolreactionbuffer、120～150μmol/L金属离子指示剂、1～3μL安卡拉病毒DNA模板，最后用ddH2O补足至25～50μL；(4)将步骤(3)建立的反应体系置于60～70℃的恒温体系中反应60～80min，然后再在80～90℃反应5～10min即可。2.根据权利要求1所述的基于LAMP技术的安卡拉病毒快速检测方法，其特征在于，步骤(3)中所述反应体系包括：6mMMgSO4、1.4mMdNTPmix、1.6μM内引物、0.2μM外引物、0.4μM环引物、320U/mLBst3.0DNA聚合酶、2.5μL10×Thermopolreactionbuffer、120μmol/L金属离子指示剂、2μL安卡拉病毒...

【专利技术属性】
技术研发人员：韩新锋，赵艳，姜朕元，李佳康，黄雪琳，周海洋，申玉玺，赵勤，黄勇，
申请(专利权)人：四川农业大学，
类型：发明
国别省市：四川,51