一种包含TRAIL和IgG结合结构域的融合蛋白及其用途制造技术

本发明专利技术公开了一种包含TRAIL结构域和IgG结合结构域IgBD的重组蛋白。在该重组蛋白中，IgBD可融合在TRAIL结构域的N‑末端或C‑末端。该重组蛋白与内源性或外源性IgG结合后的抗肿瘤作用显著强于TRAIL，在治疗死亡受体高表达的细胞增生性疾病中有良好的应用前景。

A Fusion Protein Containing TRAIL and IgG Binding Domains and Its Application

【技术实现步骤摘要】
一种包含TRAIL和IgG结合结构域的融合蛋白及其用途
本专利技术属于生物技术药物领域，具体涉及一种包含TRAIL和IgG结合结构域的融合蛋白及其用途。
技术介绍
TRAIL是肿瘤坏死因子TNF(TumorNecrosisFactor)超家族成员。TRAIL有四种膜受体，即TRAILR1，R2，R3和R4。这些受体中，只有TRAILR1(DR4)和R2(DR5)是死亡受体(DeathReceptor，DR)，分子内含有完整的死亡结构域。一旦与TRAIL结合，死亡受体即被活化，通过死亡结构域向胞内传递信号，诱导细胞凋亡。而TRAILR3(DcR1)和R4(DcR2)却是诱骗受体(DecoyReceptor，DcR)，分子内缺乏死亡结构域或该结构不完整，与TRAIL结合后不能传递死亡信号，不诱导细胞凋亡(Wiezoreketal.ClinCancerRes.2010；16：1701-8；Oikonomouetal.，BioFactors.2013；39：343-54)。死亡受体DR4和/或DR5广泛高表达于肿瘤细胞，而诱骗受体DeR1和DcR2在正常细胞高表达。且TRAIL对死亡受体的结合能力远高于其对诱骗受体的结合能力。因此，低浓度的TRAIL即可诱导肿瘤细胞凋亡。即便在高浓度情况下，TRAIL对正常细胞的伤害也很小，是理想的抗肿瘤候选药物(Wajantetal.，CancerLett.2013；332：163-74；Limetal.ExpertOpinTherTargets.2015；19：1171-85)。TRAIL有膜结合型和可溶型两类。膜结合型TRAIL由281个氨基酸组成，包含N末端疏水跨膜区和暴露于胞膜外的C末端亲水区。膜结合型TRAIL主要表达于免疫细胞(如T细胞和自然杀伤细胞等)表面，其胞外段也能从细胞表面脱落进入血液，被称为可溶型TRAIL。体外实验发现，重组表达的可溶型TRAIL在纳摩尔(nM)级别浓度下就能诱导多种肿瘤细胞凋亡。但即便在1000倍以上的浓度(μM)条件下，TRAIL对正常细胞也无明显细胞毒性。临床试验也证明TRAIL具有良好的安全性。但是，与体外具有超强的肿瘤细胞杀伤活性相比，TRAIL的体内抗肿瘤效果，尤其是临床抗肿瘤效果远远低于预期。“半衰期短”被认为是导致TRAIL体内抗肿瘤效果不理想的首要原因事实也证明，TRAIL在实验动物体内的半衰期只有十几分钟，在人体的半衰期也不到1小时(Stuckeyetal.，TrendsMolMed.2013；19：685-94；Limetal.ExpertOpinTherTargets.2015；19：1171-85)。因此，延长半衰期，极有可能显著提高TRAIL体内抗肿瘤效果，促进其临床应用。为延长其半衰期，研究者们先后利用多种方法对TRAIL进行了修饰。这些方法包括：PEG或聚糖修饰，纳米材料包被，Fc融合，白蛋白融合/偶联/结合等。如Kim等(BioconChem.2011；22：1631-7)利用分子量20kDa及以上的PEG定点修饰，将TRAIL半衰期延长了10-20倍；Wang等(MolCancerTher，2014；13：643-50)通过Fc融合，将TRAIL半衰期延长了10倍左右。Muller等(BiochemBiophysResCommun，2010；396：793-9)将TRAIL与白蛋白融合，也使其半衰期延长了15倍左右。这些方法都延长了TRAIL半衰期，提高了其体内抗肿瘤效果。不过，PEG修饰及融合大分子Fc或白蛋白，以及偶联白蛋白等方法均面临过程复杂、产率低、产物不均一、成本高等问题。研究发现，血液中的IgG抗体进入细胞后，在内涵体的酸性条件下，可与其受体FcRn结合形成复合物而逃避溶酶体降解。之后，IgG-FcRn复合物可被送至胞外。此时，IgG被释放出来，再次进入血液循环。这一过程称为FcRn介导的再循环。众所周知，绝大多数天然蛋白质的半衰期仅为数分钟或数小时。而FcRn介导的再循环使IgG显示了超长(2-3周)的半衰期(Pyziketal.JImmunol，2015；194：4595-603；Sockoloskyetal.，AdvDrugDelivRev.2015；91：109-24)。此外，IgG抗体还可介导抗体依赖性细胞杀伤等作用(Wangetal.FrontImmunol.2015；6：368)。因此，若能利用IgG抗体作为载体，不仅可能延长药物的半衰期、增强药物靶向性，还可能引入抗体杀伤靶细胞的作用。为了利用抗体作为TRAIL的载体，传统的方法是将抗体或抗体片段与TRAIL融合表达。但该项技术，尤其是将TRAIL与完整抗体融合表达主要面临因表达产物分子量过大导致的技术难，产量低，周期长和成本高的问题(SiegemundMetal，Mabs，2016，8：879-891；SiegemundMetal，Scientificreport，2018，8：7808)。
技术实现思路
为了解决上述问题，本专利技术提出将具有抗体结合能力、分子量小的IgG结合结构域(IgG-bindingdomain)与TRAIL融合，通过改造赋予TRAIL结合IgG的能力。经改造具有IgG结合能力的TRAIL，无论是直接注入体内与内源性IgG结合，还是与外源性IgG结合后再注入体内，都可能通过延长半衰期，增强靶向性而发挥更优的体内效果。具体地：本专利技术提供了一种重组IgBD-TRAIL蛋白及其用途。IgG是免疫球蛋白G(ImmunoglobulinG，IgG)的缩写。IgBD为免疫球蛋白G(IgG)的结合结构域(IgG-bindingDomain，IgBD)。TRAIL为肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TNFrelatedapoptosis-inducingligand，TRAIL)，是一种具有高效选择性杀伤肿瘤细胞特性的蛋白。ProteinG为链球菌蛋白G，是链球菌表面的一种细胞壁蛋白。本专利技术提供了一种融合蛋白，它包含：(1)肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体的功能性片段结构域(a)或与该功能性片段具有至少80％同源性的结构域；和(2)免疫球蛋白G的结合结构域(b)或与该结构域具有至少80％同源性的结构域；优选地，所述的肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体为猴或人的肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体；免疫球蛋白G的结合结构域(b)来自于链球菌蛋白G；结构域(b)通过连接子连接在结构域(a)的N端。其中，它包含：(1)与肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体的功能性片段结构域(a)具有至少90％同源性的结构域；和(2)与免疫球蛋白G的结合结构域具有至少90％同源性的结构域。其中，所述的肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体的功能性片段结构域的氨基酸序列如SEQIDNO：1或14所示。其中，所述的免疫球蛋白G的结合结构域的氨基酸序列如：SEQIDNO：2或3所示。其中，所述的连接子是(G4S)3连接子，其氨基酸序列如SEQIDNO：4所示。其中，它的氨基酸序列如SEQIDNO：5、6或16任意一项所示。其中，它由SEQIDNO：7、8或15任意一项所示的核苷酸序列编码。本专利技术还提供了一种核苷酸序列，它包含：(1)肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体TRAIL的功能性片本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种融合蛋白，其特征在于：它包含：(1)肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体的功能性片段结构域(a)或与该功能性片段具有至少80％同源性的结构域；和(2)免疫球蛋白G的结合结构域(b)或与该结构域具有至少80％同源性的结构域；优选地，所述的肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体为猴或人的肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体；免疫球蛋白G的结合结构域(b)来自于链球菌蛋白G；结构域(b)通过连接子连接在结构域(a)的N端。

【技术特征摘要】
2018.02.08 CN 20181012833301.一种融合蛋白，其特征在于：它包含：(1)肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体的功能性片段结构域(a)或与该功能性片段具有至少80％同源性的结构域；和(2)免疫球蛋白G的结合结构域(b)或与该结构域具有至少80％同源性的结构域；优选地，所述的肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体为猴或人的肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体；免疫球蛋白G的结合结构域(b)来自于链球菌蛋白G；结构域(b)通过连接子连接在结构域(a)的N端。2.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于：它包含：(1)与肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体的功能性片段结构域(a)具有至少90％同源性的结构域；和(2)与免疫球蛋白G的结合结构域具有至少90％同源性的结构域。3.根据权利要求1或2所述的融合蛋白，其特征在于：所述的肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体的功能性片段结构域的氨基酸序列如SEQIDNO：1或14所示。4.根据权利要求1或2所述的融合蛋白，其特征在于：所述的免疫球蛋白G的结合结构域的氨基酸序列如：SEQIDNO：2或3所示。5.根据权利要求1或2所述的融合蛋白，其特征在于：所述的连接子是(G4S)3连接子，其氨基酸序列如SEQIDNO：4所示。6.根据权利要求1或2所述的融合蛋白，其特征在于：它的氨基酸序列如SEQIDNO：5、6或16任意一项所示。7.根据权利要求6所述的融合蛋白，其特征在于：它由SEQIDNO：7、8或15任意一项所示的核苷酸序列编码。8.一种核苷酸序列，其特征在于：它包含：(1)肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体TRAIL的功能性片段结构域(a)或与该功能性片段具有至少80％同源性的结构域的基因编码序列；和(2)免疫球蛋白G的结合结构域(b)或与该结构域具有至少80％同源性的结构域的基因编码序列；优选地，所述的肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体为猴或人的肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体；免疫球蛋白G的结合结构域(b)来自于链球菌蛋白G。9.根据权利要求8所述的核苷酸序列，其特征在于：它包含：(1)与肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体TRAIL的功能...

【专利技术属性】
技术研发人员：卢晓风，杨浩，陶泽，程惊秋，
申请(专利权)人：四川大学华西医院，
类型：发明
国别省市：四川,51