一种用于检测甲基化对miRNA和mRNA结合影响的方法，涉及分子生物学技术领域。该方法包括：比较第一反应体系和第二反应体系的荧光强弱；第一反应体系中含有mRNA与miRNA，其中，mRNA与miRNA均未甲基化；第二反应体系中mRNA与miRNA，其中，mRNA与miRNA中的任意一者具有甲基化位点；第一反应体系和第二反应体系中的mRNA和miRNA均标记有荧光染料。本申请提供了一种新的，利用比较第一反应体系以及第二反应体系的荧光强弱，实现可视化检测甲基化对miRNA和mRNA结合作用的影响的方法，同时该方法还具有实现简单、反应灵敏、以及可快速高效的得到测试结果的优点。
A method for detecting the effects of methylation on the binding of microRNAs to RNA
【技术实现步骤摘要】
用于检测甲基化对miRNA和mRNA结合影响的方法
本申请涉及分子生物学
，具体而言，涉及一种用于检测甲基化对miRNA和mRNA结合影响的方法。
技术介绍
RNA的甲基化，包括mRNA、lncRNA和miRNA等的甲基化，是哺乳动物体内存在的一种普遍的RNA修饰方式，参与多种生物过程的表观遗传调控，比如mRNA的稳定性、可变剪接和蛋白翻译等生物过程。RNA的甲基化对细胞状态调节、性别决定和发育至关重要，RNA的甲基化的失调与肥胖、癌症等人类疾病密切相关。微小RNA(miRNA)是一类由内源基因编码的长度约22nt的单链RNA，在进化上具有高度的保守性，能够通过与靶基因mRNA的碱基特异性互补配对，引起靶基因降解或者抑制其翻译，从而对靶基因进行转录后的表达调控。目前miRBase数据库收录了人类1881条miRNA前体序列和2588条miRNA成熟序列，这些miRNA却调控了至少60％人类编码蛋白基因的表达。miRNA的调控作用也具有高度的保守性，参与调控机体生长、发育和代谢等多种生命活动，miRNA的表达失调与癌症、心血管疾病、化学性肝损伤等人类疾病的发生发展密切相关。因此，研究甲基化对miRNA和靶基因mRNA序列结合作用的影响具有非常重要的意义。目前研究甲基化对miRNA和mRNA结合作用影响的检测只有双荧光素酶报告基因实验一种方法，主要是通过构建靶基因mRNA双荧光素酶报告基因载体联合miRNA模拟物转染细胞，裂解细胞后提取上清液检测荧光素酶的表达情况来判断甲基化对miRNA和mRNA结合作用的影响。但该技术操作繁琐复杂，所需试剂种类多，耗时长。
技术实现思路
本申请提供一种用于检测甲基化对miRNA和mRNA结合影响的方法，具体地，本申请提供一种基于荧光的用于检测甲基化对miRNA和mRNA结合作用影响的可视化方法，以解决上述至少一个问题。根据本申请实施例的提供的一种用于检测甲基化对miRNA和mRNA结合影响的方法，其包括：比较第一反应体系和第二反应体系的荧光强弱；第一反应体系中含有mRNA与miRNA，其中，mRNA与miRNA均未甲基化；第二反应体系中含有mRNA与miRNA，其中，mRNA与miRNA中的任意一者具有甲基化位点；第一反应体系和第二反应体系中的mRNA和miRNA均标记有荧光染料；若第二反应体系的结合复合物的荧光值小于第一反应体系的结合复合物的荧光值和/或第二反应体系的游离核苷酸单体的荧光值大于第一反应体系的游离核苷酸单体的荧光值，则指示甲基化减弱了miRNA与mRNA的结合；若第二反应体系的结合复合物的荧光值与第一反应体系的结合复合物的荧光值相同和/或第二反应体系的游离核苷酸单体的荧光值与第一反应体系的游离核苷酸单体的荧光值相同，则指示甲基化不影响miRNA与mRNA的结合。也即是，本申请提供了一种新的用于检测甲基化对miRNA和mRNA结合影响的方法，通过比较第一反应体系以及第二反应体系的荧光强弱，实现可视化检测甲基化对miRNA和mRNA结合作用的影响，同时该方法还具有实现简单、反应灵敏、以及可快速高效的得到测试结果的优点。另外，根据本申请实施例的用于检测甲基化对miRNA和mRNA结合影响的方法还具有如下附加的技术特征：本申请示出的一些实施例中，第一反应体系以及第二反应体系中，mRNA与miRNA的摩尔比均为1:1。上述比例条件下，可保证mRNA与miRNA可以达到充分结合的条件且避免mRNA或miRNA过多，导致的游离的mRNA或miRNA多，影响荧光强度导致影响可视化检测结果或判断。本申请示出的一些实施例中，第一反应体系和第二反应体系中均包括DEPC-H2O以及Bingdingbuffer。其中，DEPC-H2O的引入有效防止mRNA与miRNA的降解，影响荧光强度，导致检测结果不准确的问题。可选地，第一反应体系包括体积比依次为8:1:1:10的Bindingbuffer、400nM的mRNA、400nM的miRNA以及DEPC-H2O，第二反应体系包括体积比依次为8:1:1:10的Bindingbuffer、400nM的mRNA、400nM的miRNA以及DEPC-H2O。保证第一反应体系以及第二反应体系中mRNA与miRNA的活性，同时防止mRNA与miRNA降解，避免处甲基化以外的其他因素的干扰，保证较佳的状态便于结合，以判断甲基化对miRNA和mRNA结合影响。可选地，Bindingbuffer由100mM的pH7.2-7.4的HEPESBuffer、50％的glycerol、2M的KCl和1M的MgCl2等体积混合所得。例如以20μl反应体系为例，Bindingbuffer由100mMHEPESBuffer(pH7.3，2μl)，50％glycerol(2μl)，2MKCl(2μl)和1MMgCl2(2μl)混合所得。可选地，第一反应体系以及第二反应体系均由以下方式获得：将mRNA与miRNA用DEPC-H2O稀释后，于94-96℃加热1.5-2.5min，随后放冰上冷却1.8-2.5min后添加于Bingdingbuffer中孵育所得。通过先使用DEPC-H2O稀释，溶解miRNA和mRNA且抑制miRNA和mRNA的降解，保证miRNA和mRNA结合的稳定性。可选地，孵育在24-26℃保温18-22min。例如孵育在24℃、24.5℃、25℃、25.5℃或26℃中的任一点或任意两点之间的范围值内保温18-22min，使miRNA和mRNA充分结合。可选地，本申请中，第一反应体系和第二反应体系的荧光的获得方式如下：将第一反应体系以及第二反应体分别电泳后，经成像系统成像所得。换言之，将第一反应体系中的mRNA与miRNA结合反应后作为第一产物，以及将第二反应体系中的mRNA与miRNA结合反应后作为第二产物，进而将第一产物以及第二产物电泳，经电泳、成像，获得第一产物对应的第一荧光条带、以及第二产物对应的第二荧光条带，进而对比第一荧光条带与第二荧光条带的荧光强弱，判断甲基化对miRNA和mRNA结合影响。可选地，电泳为非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳。可选地，电泳采用浓度为12％的非变性聚丙烯酰胺凝胶，非变性聚丙烯酰胺凝胶由体积比依次为7.5：4.5：1.5：1.5:0.105:0.075的水、40％Acrylamide/Bis溶液、5×TBE缓冲液、甘油、过硫酸铵、TEMED混合所得。例如以15μl反应体系为例，非变性聚丙烯酰胺凝胶由水(7.5mL)，40％Acrylamide/Bis溶液(4.5mL)，5×TBE缓冲液(1.5mL)，甘油(1.5mL)，10％过硫酸铵(0.105mL)，TEMED(0.075mL)混合所得。可选地，电泳的上样缓冲液为包含有15％Ficoll和0.4％OrangeG的水溶液。可选地，聚丙烯酰氨凝胶电泳的缓冲液为0.5×TBE缓冲液，电泳在4℃且恒压为100V的条件下进行3小时。需说明的是，本申请中，miRNA包括但不限定于has-miR-1910-5p、hsa-miR-589-5p、hsa-miR-204-3p、hsa-miR-181c-5p等。mRNA包括但不限定于ACSL3、ACSL1、ACSL5等。本本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种用于检测甲基化对miRNA和mRNA结合影响的方法，其特征在于，其包括：比较第一反应体系和第二反应体系的荧光强弱；第一反应体系中含有mRNA与miRNA，其中，mRNA与miRNA均未甲基化；第二反应体系中含有mRNA与miRNA，其中，mRNA与miRNA中的任意一者具有甲基化位点；所述第一反应体系和所述第二反应体系中的mRNA和miRNA均标记有荧光染料；若所述第二反应体系的结合复合物的荧光值小于所述第一反应体系的结合复合物的荧光值和/或所述第二反应体系的游离核苷酸单体的荧光值大于所述第一反应体系的游离核苷酸单体的荧光值，则指示甲基化减弱了miRNA与mRNA的结合；若第二反应体系的结合复合物的荧光值与第一反应体系的结合复合物的荧光值相同和/或所述第二反应体系的游离核苷酸单体的荧光值与所述第一反应体系的游离核苷酸单体的荧光值相同，则指示甲基化不影响miRNA与mRNA的结合。
【技术特征摘要】
1.一种用于检测甲基化对miRNA和mRNA结合影响的方法，其特征在于，其包括：比较第一反应体系和第二反应体系的荧光强弱；第一反应体系中含有mRNA与miRNA，其中，mRNA与miRNA均未甲基化；第二反应体系中含有mRNA与miRNA，其中，mRNA与miRNA中的任意一者具有甲基化位点；所述第一反应体系和所述第二反应体系中的mRNA和miRNA均标记有荧光染料；若所述第二反应体系的结合复合物的荧光值小于所述第一反应体系的结合复合物的荧光值和/或所述第二反应体系的游离核苷酸单体的荧光值大于所述第一反应体系的游离核苷酸单体的荧光值，则指示甲基化减弱了miRNA与mRNA的结合；若第二反应体系的结合复合物的荧光值与第一反应体系的结合复合物的荧光值相同和/或所述第二反应体系的游离核苷酸单体的荧光值与所述第一反应体系的游离核苷酸单体的荧光值相同，则指示甲基化不影响miRNA与mRNA的结合。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第一反应体系以及所述第二反应体系中，mRNA与miRNA的摩尔比均为1:1。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第一反应体系和所述第二反应体系中均包括DEPC-H2O以及Bingdingbuffer。4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，Bindingbuffer由100mM的pH7.2-7.4的HEPESBuffer、50％的glycerol、2M的KCl和1M的MgCl2等体积混合所得。5.根据权利要求3所述的方法，...
【专利技术属性】
技术研发人员：于典科，罗娇，赵艳洁，靳远，郑玉新，
申请(专利权)人：青岛大学，
类型：发明
国别省市：山东,37
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