利用基因编辑技术创制玉米矮化材料的方法技术

本发明专利技术提供一种利用基因编辑技术创制玉米矮化材料的方法，包括针对玉米中的目标基因ZmGA20ox3/ZmGA20ox5设计基于CRISPR/Cas9的sgRNA，将含有编码所述sgRNA的DNA片段连接到携带Cas的载体中，用构建的载体转化玉米，实现对基因ZmGA20ox3/ZmGA20ox5的定点突变，进而获得相应基因功能缺失的转基因玉米植株。本发明专利技术首次揭示了玉米ZmGA20ox3/ZmGA20ox5基因的生物学功能，通过CRISPR/Cas9技术对玉米ZmGA20ox3/ZmGA20ox5基因进行基因编辑，并进一步筛选获得不含转基因插入片段的突变体材料，这些玉米矮化材料具有重要的育种价值。

Method of Gene Editing Technology for Making Maize Dwarfing Materials

【技术实现步骤摘要】
利用基因编辑技术创制玉米矮化材料的方法
本专利技术涉及生物技术和遗传育种领域，具体地说，涉及一种利用基因编辑技术创制玉米矮化材料的方法。
技术介绍
二十世纪玉米产量的提高主要依赖提高单位面积内玉米的种植密度(Duvicketal.,2010)，但是密度过高随之而来的就是倒伏的风险，可能会降低产量，因此在一定程度上降低玉米株高有助于提高玉米产量。上世纪60年代末，闻名于世的“绿色革命”掀起了半矮化植株可以提高产量的狂潮。在“绿色革命”期间成功创制了半矮化水稻和小麦的高产品种。在过去的几十年中许多玉米矮化突变体被鉴定，但没有完全应用到玉米育种中。赤霉素(GAs)是一种天然的四环二萜羧酸，在植物种子萌发、茎的伸长以及花的形成等生长发育过程中起着重要的作用。目前发现的赤霉素种类已经有130多种，其中有活性的赤霉素有四种，分别是GA1、GA3、GA4和GA7(Heddenetal.,2000)。在植物体内GA有两种存在形式，一种以游离态形式存在，参与植物生长代谢途径，另一种以结合态的形式存在，是不具有活性的，植物体内GA正常的含量由结合态GA与游离态GA的动态平衡来维持(Kawaide.,2006)。GA的生物合成包括以下几个步骤：1)在原生质体中栊牛儿基栊牛儿基二磷酸合成内根-贝壳杉烯；2)在内质网上内根-贝壳杉烯氧化生成GA12，GA12进一步转化成GA53；3)GA12和GA53进入到细胞质中，在一系列赤霉素氧化酶的作用下生成有活性的GA分子(Tengetal.,2012)。CRISPR/Cas9技术可以精准的对基因组中的特定部位进行编辑，既可以实现基因的敲除也可以产生特定片段的插入，成功应用于不同植物的基因组编辑，加快基因功能研究和作物分子遗传改良。通过CRISPR/Cas9技术获得玉米矮化突变体材料，有望应用到玉米育种工作中。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种利用基因编辑技术创制玉米矮化材料的方法。为了实现本专利技术目的，第一方面，本专利技术提供控制植物株高的基因，包括玉米ZmGA20ox3和/或ZmGA20ox5基因，其中，玉米ZmGA20ox3基因为编码如下蛋白质(a)或(b)的基因：(a)由SEQIDNO:1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)SEQIDNO:1所示序列经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有同等功能的由(a)衍生的蛋白质。玉米ZmGA20ox5基因为编码如下蛋白质(a′)或(b′)的基因：(a′)由SEQIDNO:2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b′)SEQIDNO:2所示序列经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有同等功能的由(a′)衍生的蛋白质。第二方面，本专利技术提供玉米ZmGA20ox3和/或ZmGA20ox5基因在玉米矮化材料育种中的应用，其是利用基因工程手段，对玉米ZmGA20ox3和/或ZmGA20ox5基因进行定点突变，使得玉米ZmGA20ox3和/或ZmGA20ox5基因功能缺失，来实现对玉米株高的遗传改良(降低株高)。第三方面，本专利技术提供利用基因编辑技术创制玉米矮化材料的方法，针对玉米中的目标基因ZmGA20ox3和/或ZmGA20ox5设计基于CRISPR/Cas9的sgRNA序列，将含有编码所述sgRNA序列的DNA片段连接到携带Cas的载体中，用构建的载体转化玉米(如农杆菌介导法)，实现对基因ZmGA20ox3和/或ZmGA20ox5的定点突变，进而获得ZmGA20ox3和/或ZmGA20ox5基因功能缺失的转基因玉米植株。优选地，针对基因ZmGA20ox3，sgRNA作用位点的核苷酸序列为5’-GGAGCCATTCCTGTGGCCGC-3’和5’-CTGTCCTTCGGCTTCCACGA-3’。(SEQIDNO:3-4)优选地，针对基因ZmGA20ox5，sgRNA作用位点的核苷酸序列为5’-AGATCCCCGCGCCATTCCTG-3’和5’-CTGTCGTTCGGCTACCACGA-3’。(SEQIDNO:5-6)更优选地，将两个sgRNA作用位点通过不同表达盒串联到同一基因编辑载体上。本专利技术中，所述携带Cas9的载体为pBUE411。所建玉米转化载体为pBUE411-2gR-GA20ox3和pBUE411-2gR-GA20ox5。可选地，所述玉米为自交系综31。第四方面，本专利技术提供一种创制玉米矮化材料的方法，按照上述方法制备转基因玉米植株，然后转基因玉米植株进行杂交、回交、自交或无性繁殖，从而创制玉米矮化材料。优选地，所创制的玉米矮化材料中不含外源插入片段。玉米中NOD基因编码的蛋白具有调控细胞数量的功能，nod突变体在生长发育和细胞分化等方面均有缺陷，表现出叶片狭窄并且株高极度矮化(Rosaetal.,2017)。玉米blh12/blh14双突变体节间长度严重缩短引起矮化的表型，且该突变体雄穗发育畸形导致完全不育(Tsudaetal.,2017)。玉米gif1突变体叶片变窄、节间不规则地弯曲且植株变矮，雌花序长分枝增加，雄花序分枝减少(Zhangetal.,2018)。本专利技术创制的玉米矮化材料属于半矮化材料，节间发育正常且可正常结实，与矮化严重、矮化后不育及矮化后节间发育不规则的玉米材料相比，更适合应用于杂交玉米生产。借由上述技术方案，本专利技术至少具有下列优点及有益效果：本专利技术首次揭示了玉米ZmGA20ox3和/或ZmGA20ox5基因的生物学功能，通过CRISPR/Cas9技术对玉米ZmGA20ox3和/或ZmGA20ox5基因进行基因编辑，并进一步筛选获得不含转基因插入片段的突变体材料，这些玉米矮化材料具有重要的育种价值。附图说明图1为本专利技术实施例5中纯合突变体靶位点突变序列的分析结果。图2为本专利技术实施例5中ZmGA20ox3基因编辑植株株高对比结果。其中，A：发生编辑的杂合突变体及纯合突变体材料与野生型玉米植株的高矮比较；B：植株高矮的柱形图。图3为本专利技术实施例6中无转基因片段突变体植株筛选结果。具体实施方式以下实施例用于说明本专利技术，但不用来限制本专利技术的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(SambrookJ&RussellDW,MolecularCloning:aLaboratoryManual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。实施例1设计基于CRISPR/Cas9的编辑位点通过CRISPR-P(http://crispr.hzau.edu.cn/CRISPR2/)网站设计靶标位点，玉米目的基因ZmGA20ox3、ZmGA20ox5及相关信息从数据库MaizeGDB(https://www.maizegdb.org/)下载。将目的基因的外显子序列上传到CRISPR-P网站，选择参考基因组为玉米基因组，获得临近5’-NGG的潜在编辑位点。每个基因设计两个靶位点，且位于基因的第一个外显子上，两个靶位点(位于不同表达盒)串联到同一个基因编辑载体上。ZmGA20ox3靶位点序列为5’-GGAGCCATTCCTGTGGCCGC-3’和5’-CTGTCCTTCGGCTTCCACGA-3’，ZmGA20ox5靶位点序列为5’-AGATCCCCGCGCCATTCCTG-3’和5’-CTG本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.控制植物株高的基因，其特征在于，包括玉米ZmGA20ox3和/或ZmGA20ox5基因，其中，玉米ZmGA20ox3基因为编码如下蛋白质(a)或(b)的基因：(a)由SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)SEQ ID NO:1所示序列经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有同等功能的由(a)衍生的蛋白质；玉米ZmGA20ox5基因为编码如下蛋白质(a′)或(b′)的基因：(a′)由SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b′)SEQ ID NO:2所示序列经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有同等功能的由(a′)衍生的蛋白质。

【技术特征摘要】
1.控制植物株高的基因，其特征在于，包括玉米ZmGA20ox3和/或ZmGA20ox5基因，其中，玉米ZmGA20ox3基因为编码如下蛋白质(a)或(b)的基因：(a)由SEQIDNO:1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)SEQIDNO:1所示序列经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有同等功能的由(a)衍生的蛋白质；玉米ZmGA20ox5基因为编码如下蛋白质(a′)或(b′)的基因：(a′)由SEQIDNO:2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b′)SEQIDNO:2所示序列经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有同等功能的由(a′)衍生的蛋白质。2.权利要求1所述基因在玉米矮化材料育种中的应用，其特征在于，其是利用基因工程手段，对玉米ZmGA20ox3和/或ZmGA20ox5基因进行定点突变，使得玉米ZmGA20ox3和/或ZmGA20ox5基因功能缺失，来实现对玉米株高的遗传改良。3.利用基因编辑技术创制玉米矮化材料的方法，其特征在于，针对玉米中的目标基因ZmGA20ox3和/或ZmGA20ox5设计基于CRISPR/Cas9的sgRNA序列，将含有编码所述sgRNA序列的DNA片段连接到携带Cas的载体中，用构建的载体转化玉米，实现对基因ZmGA20...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘允军，张姣姣，王国英，
申请(专利权)人：中国农业科学院作物科学研究所，
类型：发明
国别省市：北京,11