一种噬菌体展示口蹄疫颗粒、制备方法及疫苗技术

本发明专利技术属于兽用生物制品领域，公开了一种噬菌体展示口蹄疫颗粒、制备方法及疫苗，噬菌体展示口蹄疫颗粒为噬菌体展示A型口蹄疫颗粒或噬菌体展示O型口蹄疫颗粒；其中噬菌体展示A型口蹄疫颗粒由A型口蹄疫病毒结构蛋白VP1与噬菌体衣壳组合在一起，噬菌体展示O型口蹄疫颗粒由O型口蹄疫病毒结构蛋白VP1与噬菌体衣壳组合在一起。本发明专利技术的噬菌体口蹄疫颗粒是由口蹄疫病毒的结构蛋白VP1与噬菌体组成，结构稳定，不仅温度稳定性及酸碱环境稳定性增加，而且制备的口蹄疫噬菌体颗粒可以快速的诱导特异性抗体的产生，免疫持续期延长，而且降低了生产成本以及佐剂的使用量。

A bacteriophage displaying foot-and-mouth disease granule, preparation method and vaccine

【技术实现步骤摘要】
一种噬菌体展示口蹄疫颗粒、制备方法及疫苗
本专利技术属于兽用生物制品领域，尤其涉及一种噬菌体展示口蹄疫颗粒、制备方法及疫苗，具体涉及口蹄疫VP1衣壳蛋白与噬菌体展示系统组合产生的噬菌体展示口蹄疫颗粒疫苗以及组合应用。
技术介绍
目前，业内常用的现有技术是这样的：口蹄疫(footandmouthdisease,FMD)是由口蹄疫病毒(footandmouthdiseasevirus,FMDV)引起的一种急性、热性、高摄氏度接触传染性的偶蹄动物烈性疫病。口蹄疫能够造成严重的经济和社会问题，被世界动物卫生组织(OIE)列为法定报告病种，我国定为一类动物疫病。根据动物交叉保护和血清学型试验可将FMDV分为O、A、C、SAT1、SAT2、SAT3和Asial等7个血清型。口蹄疫病毒各型间无交叉反应，各型又根据抗原亲缘关系分为不同的亚型，型之间无交叉免疫保护作用。其中，O型口蹄疫是全球最主要的流行亚型。在我国及周边国家多次爆发O型口蹄疫，造成了重大经济损失。利用噬菌体展示技术制备的疫苗有安全性高、稳定性强、制作简单、易于贮存运输等优点，已日益引起人们的广泛重视。2009年，在欧洲举行的世界流感大会对噬菌体衍生的病毒样颗粒(Virus-likeparticles，VLPs)作为传输载体的疫苗高摄氏度关注。噬菌体展示技术已广泛应用于预防性疫苗与治疗性疫苗的研制。噬菌体颗粒疫苗不仅能注射免疫，还可采用多种免疫途径。在规模化养殖条件下，良好的经口免疫效果对于疫苗特别是基因工程疫苗的推广使用意义重大。基因工程疫苗包括重组蛋白疫苗、DNA疫苗和病毒载体疫苗。噬菌体疫苗属于病毒载体疫苗，其兼有重组蛋白疫苗和DNA疫苗的优点:比其他病毒载体疫苗更安全方便；比一般蛋白疫苗更易于制备纯化；比DNA疫苗更安全可靠。因此，噬菌体疫苗在新型疫苗的研制上具有广阔的应用前景。噬菌体展示技术作为一种新型技术，将成为简单、有效、具有广阔应用前景的新型疫苗研制工具。FMDV是人类最早确认的一种动物病毒，具有群体庞大、复制突变率高、繁殖周期短等特征。FMDV以“准种(quasispecies)”状态生存和演变，在突变(mutation)、遗传漂移(geneticdrift)、重组(recombination)和基因迁移(migration)等多种机制和环境压力作用下，不断进化，导致病毒适应性、种群大小和种群平衡、瓶颈事件等准种特性的变化，形成了具有明显区域特征的变异体(毒株)，其宿主嗜性、毒力、抗原性等表型呈现差异。因此，急需开发一种有效又实用的口蹄疫疫苗，用于预防口蹄疫。综上所述，现有技术存在的问题是：(1)现有技术中，口蹄疫灭活疫苗在我国控制该病的过程中扮演了极其重要的角色，但也存在诸多缺点，表现为有效抗原含量低、免疫效果较差、免疫期较短，不能有效刺激机体产生细胞免疫应答且只能维持较短的中和抗体水平。国内有生产厂家6家(威特、天康、中牧、金宇、保山、必威安泰)，生产的疫苗种类有14种主要为灭活疫苗。中农威特公司是经农业部批准的国内唯一家生产全部系列口蹄疫灭活疫苗的生产厂家，共生产8种，国内独家生产的有4种。(2)现有的口蹄疫疫苗，疫苗制作过程中的种毒必须为强毒，存在严重的生物安全隐患和生产成本较高等问题。(3)现有口蹄疫疫苗中，合成肽疫苗尽管能够刺激机体产生高水平的中和抗体，但它们在实际生产中对免疫动物的保护效果往往达不到预期水平。因为人工合成的小肽并不是所有病毒唯一的中和位点，而且由于分子较小，导致空间构象简单，并不一定能够被宿主机体所识别或者不能充分诱导机体产生特异性免疫应答。(4)江苏农科院国家兽用生物制品工程技术研究中心的徐海，王义伟，侯继波等申请了《猪O型口蹄疫重组噬菌体疫苗及其构建方法》专利。专利技术提供了一种猪O型口蹄疫重组噬菌体疫苗及其构建方法，以重组噬T7菌体为抗原,重组T7噬菌体表面表达有氨基酸序列Mya98谱系。吴健敏，涂长春，任兆钧，美国马里兰州大学医学院，生物化学及分子生物研究中心《以T4SOC-HOC噬菌体双展示系统在SOC、HOC位点同时展示猪瘟病毒E2抗原和狂犬病病毒糖蛋白的研究工作》。龙良启，何玉龙进行了从噬菌体12肽库中筛选出了几个良好的噬菌体展示口蹄疫肽段的研究。以上提到的国际以及国内研究，目前仅限于实验室阶段，没有应用到实际生产当中。解决上述技术问题的难度和意义：口蹄疫是由具有抗原易变性、血清多样性为特征的口蹄疫病毒引起的一种急性、热性、高度接触性传染病。口蹄疫的不同型之间没有交叉免疫保护性，并且不同亚型之间也只有部分交叉免疫保护性，所以口蹄疫的有效防控十分困难。口蹄疫对国家的影响有政治、经济影响，军事和公共卫生危害。口蹄疫的防控形势严峻。根据动物交叉保护和血清学型试验可将FMDV分为O、A、C、SAT1、SAT2、SAT3和Asial等7个血清型。口蹄疫病毒各型间无交叉反应，各型又根据抗原亲缘关系分为不同的亚型，型之间无交叉免疫保护作用。FMDV分子进化的“准种”特性决定其具有超强的变异能力和宽泛的宿主适应性。其中，O型口蹄疫是全球最主要的流行亚型。在我国及周边国家多次爆发O型口蹄疫，造成了重大经济损失。噬菌体是感染细菌、真菌、藻类、放线菌或螺旋体等微生物的病毒的总称，因部分能引起宿主菌的裂解故称为噬菌体。噬菌体展示技术(phagedisplaytechnology)是将外源蛋白或多肽的DNA序列插入到噬菌体外壳蛋白结构基因的适当位置，使外源基因随外壳蛋白的表达而表达，同时，外源蛋白随噬菌体的重新组装而展示到噬菌体表面的生物技术。该技术将特定蛋白基因在其表面进行融合表达，实现了表型与基因型的统一。通过将噬菌体展示技术与口蹄疫结合，期待可以获取一种安全性高、稳定性强、制作简单、易于贮存运输等优点的疫苗。为我国口蹄疫防治提供一种有力的技术支持。
技术实现思路
针对现有技术存在的问题，本专利技术提供了一种噬菌体展示口蹄疫颗粒、制备方法及疫苗。本专利技术是这样实现的，一种噬菌体展示口蹄疫颗粒，所述噬菌体展示口蹄疫颗粒为噬菌体展示A型口蹄疫颗粒或噬菌体展示O型口蹄疫颗粒；其中噬菌体展示A型口蹄疫颗粒由A型口蹄疫病毒结构蛋白VP1与噬菌体衣壳组合在一起，口蹄疫的衣壳蛋白VP1表达到了T7噬菌体的外壳上，显示噬菌体展示O型口蹄疫颗粒由O型口蹄疫病毒结构蛋白VP1与T7噬菌体衣壳组合在一起。进一步，A型口蹄疫病毒结构蛋白VP1氨基酸序列为SEQIDNO.1。AKT-IIIVP1氨基酸序列242个氨基酸为：TTATGESADPVTTTVENYGGETQVQRRHHTDVSFIMDRFVQIKPVSPTHVIDLMQTHQHGLVGAMLRAATYYFSDLEIVVNHTGRLTWVPNGAPEAALDNTSNPTAYHKAPFTRLALPYTAPHRVLATVYNGTSRYSAPATRQGDLGSLAAGLAAQLPASFNYGAVRATEIQELLVRMKRAELYCPRPLLAVEVTSQDRHKQKIIAPAKQLL。进一步，O型口蹄疫病毒结构蛋白VP1氨基酸序列为SEQIDNO.2。OMH-02VP1氨基酸序列为：TTSTGESADPVTATVENYGGETQVQRRQHTDVSFILDRFVKVTPKDQTNVLDLM本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种噬菌体展示口蹄疫颗粒，其特征在于，所述噬菌体展示口蹄疫颗粒为噬菌体展示A型口蹄疫颗粒或噬菌体展示O型口蹄疫颗粒；其中噬菌体展示A型口蹄疫颗粒由A型口蹄疫病毒结构蛋白VP1与噬菌体衣壳组合在一起，噬菌体展示O型口蹄疫颗粒由O型口蹄疫病毒结构蛋白VP1与噬菌体衣壳组合在一起。

【技术特征摘要】
1.一种噬菌体展示口蹄疫颗粒，其特征在于，所述噬菌体展示口蹄疫颗粒为噬菌体展示A型口蹄疫颗粒或噬菌体展示O型口蹄疫颗粒；其中噬菌体展示A型口蹄疫颗粒由A型口蹄疫病毒结构蛋白VP1与噬菌体衣壳组合在一起，噬菌体展示O型口蹄疫颗粒由O型口蹄疫病毒结构蛋白VP1与噬菌体衣壳组合在一起。2.如权利要求1所述的噬菌体展示口蹄疫颗粒，其特征在于，所述A型口蹄疫病毒结构蛋白VP1氨基酸序列为SEQIDNO.1；所述O型口蹄疫病毒结构蛋白VP1氨基酸序列为SEQIDNO.2。3.一种如权利要求1所述噬菌体展示口蹄疫颗的制备方法，其特征在于，所述噬菌体展示口蹄疫颗的制备方法包括：步骤一，摇菌，提质粒；步骤二，酶切，跑胶，切胶，胶回收；酶切条件3.5-4h，37摄氏度；步骤三，连接体系10微升：目的片段2微升0.02-0.06pmol/μl，载体2微升0.04pmol/μg，45摄氏度5分钟，0摄氏度2分钟；加入1微升10×Buffer,加入1微升酶；16摄氏度，12小时；步骤四，包装：将25微升提取物，分装为5管，每管5微升，加入2微升的连接产物；轻轻混合，22摄氏度，反应2小时，加入270微升M9TB，加入到800微升EP管摇起来的BLT5403中，菌液透明后，收集；保存；步骤五，噬斑测试：在M9TB培养基中接种适当的宿主菌株...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈创夫，吴鹏，王勇，吴文星，
申请(专利权)人：石河子大学，
类型：发明
国别省市：新疆,65