一种多重PCR试剂盒及用其检测弗劳地枸橼酸杆菌的方法技术

本发明专利技术属于微生物鉴定领域，具体涉及一种多重PCR试剂盒及用其快速检测弗劳地枸橼酸杆菌的方法。本发明专利技术利用弗劳地枸橼酸杆菌的三个特异性强的靶基因，设计获得三对引物对，进行电泳检测；并据此提供了一种可快速检测出弗劳地枸橼酸杆菌的多重PCR试剂盒。利用本发明专利技术提供的方法和试剂盒，可快速检测出弗劳地枸橼酸杆菌，检测的特异性强、灵敏度高、操作简单、成本低，适合进行推广使用。

A Multiplex PCR Kit and Its Application in the Detection of Citrobacter Fraudicus

【技术实现步骤摘要】
一种多重PCR试剂盒及用其检测弗劳地枸橼酸杆菌的方法
本专利技术属于微生物鉴定领域，具体涉及一种多重PCR试剂盒及用其快速检测弗劳地枸橼酸杆菌的方法。
技术介绍
弗劳地枸橼酸杆菌(Citrobacterfreundii)为肠杆菌科枸橼酸杆菌属的革兰氏阴性菌，在临床中是一种较常见的条件致病菌，在机体免疫力低下时，可能引起体表伤口组织或体内组织感染，如引起人类的呼吸道、消化道、泌尿系统和感染等疾病。同时，报道表明，弗劳地枸橼酸杆菌与散发和爆发腹泻有关，对人的食品安全和动物的饲料安全带来威胁。因此，高效、准确、快速地鉴定弗劳地枸橼酸杆菌非常重要。目前鉴定细菌的主流方法是16SrDNA高通量测序法，但使用这种方法，需将PCR扩增产物送至生物公司测序，耗时长、成本高，已经无法满足高速发展的经济社会的需求。因此，需要建立一种速度快、成本低的方法对其进行检测和鉴定。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种多重PCR试剂盒及用其快速检测弗劳地枸橼酸杆菌的方法。为实现上述专利技术目的，本专利技术所采用的技术方案是：可特异性鉴定出弗劳地枸橼酸杆菌的靶基因，所述靶基因包括：GalF基因、Ubi基因和FliC基因；所述GalF基因的序列如SEQIDNO：1所示；所述Ubi基因的序列如SEQIDNO：2所示；所述FliC基因的序列如SEQIDNO：3所示。相应的，利用所述GalF基因设计的引物对序列如SEQIDNO：4和SEQIDNO：5所示；和/或：利用所述Ubi基因设计的引物对序列如SEQIDNO：6和SEQIDNO：7所示；和/或；利用所述FliC基因设计的引物对序列如SEQIDNO：8和SEQIDNO：9所示。相应的，一种检测弗劳地枸橼酸杆菌的试剂盒，所述试剂盒中至少包括利用GalF基因和/或Ubi基因和/或FliC基因设计获得的引物对。优选的，所述试剂盒中至少同时包括利用GalF基因、Ubi基因、FliC基因中的任意两个基因设计获得的引物对。优选的，所述试剂盒中同时包括利用GalF基因、Ubi基因、FliC基因设计获得的引物对。相应的，一种检测弗劳地枸橼酸杆菌的方法，所述方法利用弗劳地枸橼酸杆菌的GalF基因和/或Ubi基因和/或FliC基因进行。优选的，所述方法同时利用弗劳地枸橼酸杆菌的GalF基因、Ubi基因、FliC基因进行。优选的，所述方法具体为：利用所述各基因设计出引物对进行检测。本专利技术具有以下有益效果：1、本专利技术提供了弗劳地枸橼酸杆菌的全新鉴定基因：GalF基因、Ubi基因和FliC基因，并相应扩增出鉴定效果优异的对应引物。使用所述靶基因鉴定弗劳地枸橼酸杆菌，特异性强、灵敏度高。2、本专利技术利用所述全新的靶基因，提供了一种多重PCR试剂盒，使用该试剂盒检测弗劳地枸橼酸杆菌，快速、有效、准确、灵敏度高、特异性强，可实际应用于生产或科研工作中。附图说明图1为弗劳地枸橼酸杆菌单一引物的PCR扩增结果示意图；图2为弗劳地枸橼酸杆菌三重PCR扩增结果示意图；图3为本专利技术特异性试验结果示意图；图4为本专利技术灵敏度试验结果示意图。具体实施方式下面结合具体实施例，对本专利技术进行进一步阐释。实施例中涉及的培养基均为常规培养基，基本组分和来源如下：1、LB液态培养基(g/L)：TRYPTONE10.0、YEASTEXTRACT5.0、氯化钠10.0。2、LB固态培养基(g/L)：TRYPTONE10.0、YEASTEXTRACT5.0、氯化钠10.0、琼脂粉15。3、MBS液态培养基(g/L)：葡萄糖3.8，TRYPTONE3.8，淀粉2.3，氯化钠3.3，KH2PO43.3。4、MBS固态培养基(g/L)：葡萄糖3.8，TRYPTONE3.8，淀粉2.3，氯化钠3.3，KH2PO43.3，琼脂粉15。5、MRS液态培养基、MRS固态培养基均购于青岛高科园海博生物技术有限公司。实施例一：PCR扩增引物的设计及效果展示1、PCR扩增引物设计与合成选择GeneBank中弗劳地枸橼酸杆菌基因组中的GalF基因、Ubi基因和FliC基因作为靶基因。所述GalF基因的序列如SEQIDNO:1所示；所述Ubi基因的序列如SEQIDNO:2所示；所述FliC基因的序列如SEQIDNO:3所示。根据各所述基因的序列，分别选择各所述基因序列中最能代表弗劳地枸橼酸杆菌的一部分，用PrimerPremier5.0软件分别对应设计三对引物，所述各对引物的具体序列如表1所示。其中，引物对1为FgalF-1F和FgalF-1R，分别扩增GalF基因的正向和反向序列；引物对2为Fubi-4F和Fubi-4R，分别扩增Ubi基因的正向和反向序列；引物对3为FfliC-2F和FfliC-2R，分别扩增FliC基因的正向和反向序列。上述引物均由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。表1PCR扩增引物序列展示2、DNA模板的制备按照无菌操作要求，将弗劳地枸橼酸杆菌保种菌株接种于LB固态培养基活化培养，活化后，挑取所述LB固态培养基上的单菌落接于LB液态培养基中，37℃恒温摇床培养三代，随后取1～5ml菌液提取DNA。所用弗劳地枸橼酸杆菌菌株保种于西南民族大学青藏高原动物遗传资源保护与利用重点实验室。使用TIANGEN公司的DNA提取试剂盒进行DNA提取，所述DNA提取试剂盒为细菌基因组DNA提取试剂盒(离心柱型)，目录号：DP302。所述菌液中提取DNA的操作步骤如下：(1)取细菌培养液1～5ml，10000rpm(～11500×g)离心，吸净上清，获得菌体沉淀。(2)向菌体沉淀中加入200μl缓冲液GA，振荡至菌体彻底悬浮。(3)向管中加入20μl蛋白酶K溶液(ProteinaseK)，混匀。(4)加入220μl缓冲液GB，振荡15s，70℃放置10min，溶液应变清亮，简短离心以去除管盖内壁的水珠。(5)加220μl无水乙醇，充分振荡混匀15s，此时可能会出现絮状沉淀，简短离心以去除管盖内壁的水珠。(6)将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CB3(吸附柱放入收集管中)，12000rpm(～13400×g)离心30s，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。(7)向吸附柱CB3中加入500μl缓冲液GD(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，12000rpm(～13400×g)离心30s，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。(8)向吸附柱CB3中加入600μl漂洗液PW(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，12000rpm(～13400×g)离心30s，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。(9)重复操作步骤(8)。(10)将吸附柱CB3放回收集管中，12000rpm(～13400×g)离心2min，倒掉废液。将吸附柱CB3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残留的漂洗液。(11)将吸附柱CB3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加50～200μl洗脱缓冲液TE，室温放置2～5min，12000rpm(～13400×g)离心2min。(12)将步骤(11)中离心得到的溶液再加入吸附柱CB3中，室温放置2min，12000rpm(～13400×g)离心2min，将溶液收集到离心管中，即为提取的DNA。3、单一引物的PCR扩增取步骤2提取的弗劳地枸橼酸杆本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.可特异性鉴定出弗劳地枸橼酸杆菌的靶基因，其特征在于：所述靶基因包括：GalF基因、Ubi基因和FliC基因；所述GalF基因的序列如SEQ ID NO：1所示；所述Ubi基因的序列如SEQ ID NO：2所示；所述FliC基因的序列如SEQ ID NO：3所示。

【技术特征摘要】
1.可特异性鉴定出弗劳地枸橼酸杆菌的靶基因，其特征在于：所述靶基因包括：GalF基因、Ubi基因和FliC基因；所述GalF基因的序列如SEQIDNO：1所示；所述Ubi基因的序列如SEQIDNO：2所示；所述FliC基因的序列如SEQIDNO：3所示。2.权利要求1所述GalF基因扩增获得的引物对，其特征在于：利用所述GalF基因设计的引物对序列如SEQIDNO：4和SEQIDNO：5所示；和/或：利用所述Ubi基因设计的引物对序列如SEQIDNO：6和SEQIDNO：7所示；和/或；利用所述FliC基因设计的引物对序列如SEQIDNO：8和SEQIDNO：9所示。3.一种检测弗劳地枸橼酸杆菌的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中至少包括利用GalF基因和/或Ubi基因和/或FliC基因设计获得的引物...

【专利技术属性】
技术研发人员：王利，张楠驰，
申请(专利权)人：西南民族大学，
类型：发明
国别省市：四川,51