真菌中蛋白质的选择性分泌技术制造技术

本发明专利技术的目的在于提供一种用于简便获得非期望酶的量减少的培养物上清液的方法、能够用于该方法的微生物，以及使用该微生物生产目的物质的方法等。本发明专利技术涉及一种表达融合多聚核苷酸的经修饰的真菌，以及使用该经修饰的真菌生产目的物质的方法等，所述融合多聚核苷酸是编码内源性分泌酶的多聚核苷酸连接编码GPI添加信号序列的多聚核苷酸而形成的。

Selective Secretion of Proteins in Fungi

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】真菌中蛋白质的选择性分泌技术
本专利技术涉及一种表达融合多聚核苷酸的经修饰的真菌，以及使用该经修饰的真菌生产目的物质的方法等，所述融合多聚核苷酸是编码内源性分泌酶的多聚核苷酸连接编码GPI添加信号序列的多聚核苷酸而形成的。
技术介绍
为了分泌生产各种各样的酶，将真菌，特别是丝状真菌的培养物上清液用作酶制剂。但是，当把真菌的培养物上清液用作酶制剂时，会出现来自真菌的非期望酶，例如混入具有分解目的物质活性的酶的问题。为了从培养物上清液中除去非期望酶，需要纯化或分离工艺等，因此来自真菌的酶制剂存在两大问题：成本高；产量不恒定从而难以稳定供给。此外，作为减少非期望酶的量的方法，人们设想了使用编码该酶的基因被破坏的菌株的方法，但该方法可能会使真菌的增殖能力显著下降。因此，需要一种在不显著影响真菌的增殖能力的情况下，获得非期望酶的量减少的培养物上清液的方法。GPI(糖基磷脂酰肌醇)是通过翻译后修饰而添加在蛋白质C末端的糖脂质，具有将特定种类的蛋白质固定(锚定)在细胞表面的功能。目前为止，GPI用于在酵母中使蛋白质展示在细胞表面(专利文献1)，而关于将GPI应用于内源性分泌酶，则至今完全没有人考虑到。现有技术文献专利文献专利文献1：日本特表2012-511920号公报
技术实现思路
专利技术所要解决的问题本专利技术的目的在于提供一种在不显著影响真菌的增殖能力的情况下获得非期望酶的量减少的培养物上清液的方法、能够用于该方法的微生物，以及使用该微生物或培养物上清液生产目的物质的方法等。解决问题的技术方案本专利技术人发现：通过将GPI添加信号序列添加至编码内源性分泌酶的基因，内源性分泌酶会停留在细胞表层，培养物上清液中的内源性分泌酶的量减少，从而完成了本申请专利技术。因此，本申请的专利技术包含以下内容：(1)一种经修饰的真菌，其特征在于，表达融合多聚核苷酸，所述融合多聚核苷酸是在编码内源性分泌酶的多聚核苷酸的3’末端侧连接编码糖基磷脂酰肌醇(GPI)添加信号序列的外源多聚核苷酸而形成的，从而通过GPI将所述分泌酶固定在细胞表面。(2)根据(1)所述的真菌，其属于丝状真菌。(3)根据(2)所述的真菌，其属于选自由以下菌属组成的组的丝状真菌：木霉属(Trichoderma)、曲霉属(Aspergillus)、青霉属(Penicillium)、红曲霉属(Monascus)和嗜热子囊菌属(Thermoascus)。(4)根据(3)所述的真菌，其属于里氏木霉(Trichodermareesei)种。(5)根据(1)～(4)中任一项所述的真菌，其中，分泌酶选自由以下酶组成的组：糖苷酶、脂肪酶、蛋白酶和核酸酶。(6)根据(1)～(5)中任一项所述的真菌，其中，真菌用于目的物质的生产，目的物质和分泌酶选自由以下组合(a)～(d)组成的组：(a)目的物质是糖，分泌酶是糖苷酶；(b)目的物质是脂质，分泌酶是脂肪酶；(c)目的物质是蛋白质，分泌酶是蛋白酶；以及(d)目的物质是核酸，分泌酶是核酸酶。(7)根据(6)所述的真菌，其中，目的物质是纤维二糖，分泌酶是β-葡萄糖苷酶。(8)一种内源性分泌酶量减少的真菌培养物上清液的生产方法，包括以下步骤：在培养基中培养(1)～(5)中任一项所述的真菌；以及从培养的该真菌中回收内源性分泌酶量减少的培养物上清液。(9)一种目的物质的生产方法，包括以下步骤：使原料物质与(1)～(5)中任一项所述的真菌或(8)所述的真菌培养物上清液接触，以从原料物质生产目的物质。(10)根据(9)所述的方法，其中，目的物质和分泌酶为以下组合：(a)目的物质是糖，分泌酶是糖苷酶；(b)目的物质是脂质，分泌酶是脂肪酶；(c)目的物质是蛋白质，分泌酶是蛋白酶；以及(d)目的物质是核酸，分泌酶是核酸酶。(11)根据(10)所述的方法，其中，目的物质是纤维二糖，分泌酶是β-葡萄糖苷酶。(12)根据(9)～(11)中任一项所述的方法，包括以下步骤：回收目的物质。(13)一种经修饰的真菌的制作方法，所述经修饰的真菌是通过糖基磷脂酰肌醇(GPI)将内源性分泌酶固定在细胞表面的真菌，该制作方法包括以下步骤：对真菌进行修饰以表达融合多聚核苷酸，所述融合多聚核苷酸是在编码所述分泌酶的多聚核苷酸的3’末端侧连接编码GPI添加信号序列的外源多聚核苷酸而形成的。(14)根据(13)所述的方法，其中，真菌属于里氏木霉(Trichodermareesei)种。(15)根据(13)或(14)所述的方法，其中，分泌酶选自由以下酶组成的组：糖苷酶、脂肪酶、蛋白酶和核酸酶。本说明书包含了作为本申请的优先权基础的日本专利申请号2016-252330号的公开内容。在本专利技术的一实施方式中，可以获得非期望的内源性分泌酶的量减少的培养物上清液，能够将其直接用作酶制剂。此外，在一实施方式中，通过将本方法应用于真菌分泌的各种酶，可以容易地定制分泌的酶的组合，因此能够应用于与各种目的相对应的酶制剂生产和物质生产。附图说明图1表示对野生型菌株和实施例中制作的突变株(Bgl1-GPI菌株)进行PCR时的电泳结果。在Bgl1-GPI株中观察到由插入序列引起的上移，由此确认到在Bgl1-GPI菌株中在bgl1基因添加有编码GPI添加信号序列的外源多聚核苷酸。图2表示野生型菌株和实施例中制作的突变株(Bgl1-GPI菌株)的冷冻干燥菌体重量(A)和两种菌株的培养物上清液的Bgl1活性的测定结果(B)。图3表示野生型菌株和实施例中制作的突变株(Bgl1-GPI菌株)的培养物上清液的CMC酶活性(A)、CBH活性(B)和Bgl1活性的测定结果(C)。图4表示野生型菌株和实施例中制作的突变株(Bgl1-GPI菌株)的由纤维素生成的葡萄糖/纤维二糖之比的经时变化。具体实施方式1.经修饰的真菌在一实施方式中，本专利技术涉及一种经修饰的真菌。本专利技术的经修饰的真菌是在编码内源性分泌酶的多聚核苷酸的3’末端侧连接编码糖基磷脂酰肌醇(GPI)添加信号序列的外源多聚核苷酸，由此进行基因修饰而成的。本说明书中，“内源性分泌酶”是指未进行基因修饰的真菌原本分泌的所有酶，尤其是非期望分泌的酶。作为“非期望”分泌的酶的示例，例如当本专利技术的经修饰的真菌用于物质生产时，可举出：具有分解目的物质活性的酶、阻碍目的物质生产的酶、干扰目的物质活性的酶等。内源性分泌酶的具体示例没有限制，可举出：糖苷酶(特别是葡萄糖苷酶)、脂肪酶、蛋白酶和核酸酶；优选糖苷酶(特别是葡萄糖苷酶)、脂肪酶、蛋白酶；更优选糖苷酶(特别是葡萄糖苷酶)，例如纤维二糖水解酶(EC3.2.1.91)、内切葡聚糖酶(EC3.2.1.4)和β-葡萄糖苷酶(EC3.2.1.21)。当经修饰的真菌为里氏木霉(Trichodermareesei)时，内源性分泌酶优选为β-葡萄糖苷酶(EC3.2.1.21)，更优选为分泌性β-葡萄糖苷酶Bgl1、Cel3b、Cel3e、Cel3f和Cel3g中的至少一种，特别优选为Bgl1。这些酶的活性可以通过本领域技术人员公知的方法，例如使用由这些酶分解而产生荧光物质或吸光物质的底物来进行测定。例如，β-葡萄糖苷酶的活性可以使用由具有β-葡萄糖苷酶活性的酶分解而产生吸光物质的对硝基苯-β-D-吡喃葡糖苷等底物等来测定。内源性分泌酶的序列可以从公共数据库(例本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种经修饰的真菌，其特征在于，表达融合多聚核苷酸，所述融合多聚核苷酸是在编码内源性分泌酶的多聚核苷酸的3’末端侧连接编码糖基磷脂酰肌醇(GPI)添加信号序列的外源多聚核苷酸而形成的，从而通过GPI将所述分泌酶固定在细胞表面。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2016.12.27 JP 2016-2523301.一种经修饰的真菌，其特征在于，表达融合多聚核苷酸，所述融合多聚核苷酸是在编码内源性分泌酶的多聚核苷酸的3’末端侧连接编码糖基磷脂酰肌醇(GPI)添加信号序列的外源多聚核苷酸而形成的，从而通过GPI将所述分泌酶固定在细胞表面。2.根据权利要求1所述的真菌，其属于丝状真菌。3.根据权利要求2所述的真菌，其属于选自由以下菌属组成的组的丝状真菌：木霉属(Trichoderma)、曲霉属(Aspergillus)、青霉属(Penicillium)、红曲霉属(Monascus)和嗜热子囊菌属(Thermoascus)。4.根据权利要求3所述的真菌，其属于里氏木霉(Trichodermareesei)种。5.根据权利要求1～4中任一项所述的真菌，其中，分泌酶选自由以下酶组成的组：糖苷酶、脂肪酶、蛋白酶和核酸酶。6.根据权利要求1～5中任一项所述的真菌，其中，真菌用于目的物质的生产，目的物质和分泌酶选自由以下组合(a)～(d)组成的组：(a)目的物质是糖，分泌酶是糖苷酶；(b)目的物质是脂质，分泌酶是脂肪酶；(c)目的物质是蛋白质，分泌酶是蛋白酶；以及(d)目的物质是核酸，分泌酶是核酸酶。7.根据权利要求6所述的真菌，其中，目的物质是纤维二糖，分泌酶是β-葡萄糖苷酶。8.一种内源性...

【专利技术属性】
技术研发人员：玉置尚德，二神泰基，岩元正孝，
申请(专利权)人：国立大学法人鹿儿岛大学，可克意株式会社，
类型：发明
国别省市：日本,JP