单步玻璃化方法技术

一种用于冷冻保存生物材料的方法，包括在于将生物材料暴露于富含至少一种冷冻保护剂的玻璃化溶液小于90秒，然后冷却生物材料至低温保存温度的单个步骤。

One-step vitrification method

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】单步玻璃化方法
本专利技术涉及一种冷冻保存生物材料的方法，更具体地，涉及用于玻璃化生物材料的单步方法。
技术介绍
冷冻保存方法是用于在非常低的温度下保存生物材料的方法，通常为77K或-196℃，即液氮的沸点。慢速冷冻方法和玻璃化方法之间存在区别。玻璃化方法是将液体转化为无定形固体而不结晶的方法。其允许将生物材料及其介质冷却至-196℃的温度，而不会出现细胞内或细胞外冰晶体。玻璃化方法涉及将预处理的生物材料突然浸入液氮中，其取决于与材料本身和其容器相关的热惯性，产生900至20000℃/分钟范围内的冷却速率(Vanderzwalmenetal.，2010,gynecol.Obstet.Fertil.,38,541-546)。相反，任何涉及约0.5至4℃/分钟的缓慢冷却速率的冷冻保存方法是涉及细胞外水结晶的慢速冷冻技术的一部分。冷冻保存方法，特别是玻璃化方法，通常适用于人、动物或植物细胞类型的生物材料，更具体地适用于具有高个体价值的细胞，例如胚胎细胞、生殖细胞、干细胞、诱导的多能细胞、基因修饰的细胞、用于例如筛选、诊断、毒理学研究、治疗研究(如疫苗)的应用或类似应用的工具的细胞，以及组织、器官、胚胎、配子及其前体或任何其它类型的生物材料。在再生疗法、基因疗法、医学辅助生殖、诊断、药物研究和疫苗生产领域中，具有高个体价值的细胞的使用明显扩展。这些细胞的冷冻保存对于其储存、运输、筛选以及其在研究领域和生物库领域中的扩展是必不可少的，其旨在用于治疗或医学辅助生殖领域中的工业参与者或用户。为了有效，冷冻保存方法必须允许高恢复率，不论在冷却介质如液氮(LN2)中的储存时间如何，生物特性的稳定性必须是化学和(微)生物安全的，容易实施且可自动化，并且必须保证最佳的健康安全。实际上，在其使用之前的储存、运输、筛选和扩展工作依赖于此。此外，欧洲的官方指令(2004/03/EC；2006/17/EC；2006/86/EC)中陈述了适用于治疗目的的细胞冷冻保存的质量和安全限制。所有冷冻保存方法以及因此的生物材料玻璃化的方法的目的是获得和维持与冷却和再加热步骤期间获得玻璃质无定形状态相容的细胞内条件。至于特别是生物材料的玻璃化，迄今为止，普遍接受的是成功的关键取决于(i)冷却和再加热速率，(ii)细胞脱水和(iii)在它们连续暴露于具有增加浓度的冷冻保护剂(CP)的几种高渗玻璃化溶液期间冷冻保护剂(CP)渗透到生物材料如细胞或胚胎中之间的最佳平衡。玻璃化溶液由各种类型的溶质组成。其可以包括一种或多种不同的冷冻保护剂，例如丙二醇、乙二醇、Ficoll、二甲基亚砜(DMSO)、甘油、糖类(蔗糖或二糖、海藻糖、葡萄糖、果糖、蔗糖、甘露糖、蔗糖......或其衍生物)或它们的混合物。玻璃化溶液还可以包含被要求维持生物材料完整性的溶质，例如在KCl、NaCl或其它盐存在下的磷酸盐缓冲剂如K2PO4或K2HPO4，以及上述糖类，例如葡萄糖、蔗糖、右旋糖、海藻糖或其衍生物。最后，玻璃化溶液还可以包含溶质，例如人或动物血清，例如胎牛血清(fetalbovineserum)(FBS)、或胎牛血清(fetalcalfserum)(FCS)或牛血清白蛋白(BSA)，用于提供蛋白质及其冷冻保护作用。所有这些溶质也在朝向等渗渗透压的平衡的机制中起作用。如果高渗性玻璃化溶液的溶质浓度使得其对该膜施加的压力低于细胞内介质溶液(低渗性)施加的压力；则玻璃化溶液被描述为高渗性(hypertonic)或高渗(hyperosmotic)的，其是相对于通过生物或半渗透膜与玻璃化溶液分离的低渗性或低渗的另一种细胞内介质溶液而言。这导致水从细胞内膜吸引到玻璃化溶液和/或溶质通过膜的交换，以重新建立压力的平衡，从而朝着两种溶液的等渗性或等渗透压移动。在生理条件下相对于细胞内介质等渗的溶液可以描述为正常渗透压(normotonic)的。亚洲动物和兽医进展杂志(AsianJournalofAnimalandVeterinaryAdvances)11(10)2016描述了根据现有技术的根据惯例的两步玻璃化过程。在点卵母细胞或胚胎中的情况下，首先使生物材料经受含有渗透性冷冻保护剂的非玻璃化溶液，然后暴露于包含高浓度的渗透性和非渗透性冷冻保护剂的第二玻璃化溶液。在第一步中，将卵母细胞浸入例如10％(v/v)乙二醇和10％DMSO(v/v)在含有18％胎牛血清(FBS)的磷酸盐缓冲液中的溶液中，然后浸入在含有18％胎牛血清(FBS)的磷酸盐缓冲液中包含20％(v/v)的乙二醇，20％(v/v)的DMSO和0.3M海藻糖的第二玻璃化溶液中。这两个步骤允许通过细胞壁平衡的细胞内溶液和细胞外溶液的各种溶质之间的缓慢平衡。这种平衡是约10分钟的缓慢反应(参见第611页，最后一段，左栏)根据现有技术，在玻璃化方法的实施过程中，将要经受冷却步骤的最终溶液或玻璃化溶液必须是玻璃化高渗溶液(VS)，即含有渗透性和/或非渗透CP的混合物的溶液。VS的作用是在抑制细胞外冰晶体出现的玻璃化鞘中涂覆生物材料，例如细胞、胚胎等。实际上，大多数玻璃化方法包括暴露生物材料例如细胞或胚胎的几个步骤，其由浓度逐渐增加的渗透性CP的溶液组成，然后最后暴露于VS溶液中。因此，Vanderzwalmen等人在2013年4月的人类生殖(HumanReproduction)的文章中描述，对于卵母细胞和胚胎，第一系列暴露于浓度逐渐增加(约3至4M)的渗透性CP的非玻璃化溶液(nVSi)。然后将卵母细胞和胚胎暴露于玻璃化溶液(vitrifyingsolution)(VS)，也称为玻璃化溶液(vitrificationsolution)(VS)，其包含高浓度的渗透性CP(约5至6.5M)和非渗透性CP(约0.5至1M)，然后浸入液氮中。本领域技术人员已知并接受的是在nVSi暴露步骤期间逐渐增加的高浓度的冷冻保护剂(CP)是必需的，以为细胞内玻璃化状态做准备。另一方面，VS中的渗透性和非渗透性CP的混合物负责最终的细胞脱水，其浓缩细胞内组分，包括盐、蛋白质、细胞器、多糖和可选地在前面步骤中已经渗入细胞内的CP。在非渗透性冷冻保护剂(CP)中(或者考虑到相对它们非常低的膜渗透性而被认为是非渗透的那些)，是例如蔗糖、海藻糖、乳糖、甘露醇、麦芽糖、甘露糖和任何属于二糖和三糖或多糖或多元醇家族或其它衍生的或类似分子的分子。在渗透性冷冻保护剂中，例如可以提及二甲基亚砜(DMSO)、乙二醇(EG)、丙二醇(PG)、聚乙二醇、三甘醇、甘油和其它衍生的或类似的分子。虽然存在冷冻保护剂(CP)是必需的，但必须承认所有CP是潜在毒性的，尤其是渗透性CP。它们的毒性取决于所用的浓度，暴露温度和持续时间，介质的张力，细胞与产物的接触模式，以及最后取决于细胞类型。例如，二甲基亚砜(DMSO)，甘油且更特别是丙二醇(PROH)可以通过非酶促反应形成潜在毒性的甲醛。此外，DMSO被认为通过使膜蛋白去稳定化并置换与其连接的结合水而具有毒性作用。虽然每个人都认可所有的CP都是毒性的并且对降低其细胞内浓度是有益的，但目前还没有就如何在不使用它们的情况下进行冷冻保存细胞或胚胎达成共识。
技术实现思路
现在已经发现了一种新的玻璃化方法，该方法没有暴露于已知玻璃化方法特有本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于冷冻保存生物材料的方法，包括将所述生物材料暴露于富含至少一种冷冻保护剂的高渗玻璃化溶液小于90秒的时间段，然后冷却至用于冷冻保存所述生物材料的温度的单个步骤。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2016.12.27 BE BE20165981;2016.12.27 EP 16206907.41.一种用于冷冻保存生物材料的方法，包括将所述生物材料暴露于富含至少一种冷冻保护剂的高渗玻璃化溶液小于90秒的时间段，然后冷却至用于冷冻保存所述生物材料的温度的单个步骤。2.根据权利要求1所述的方法，还包括通过浸入冷却介质中在支撑物上将所述生物材料玻璃化的步骤。3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述生物材料是胚胎。4.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述生物材料包括胚胎细胞或其它相关的或衍生的细胞。5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其特征在于，玻璃化高渗溶液包含在蔗糖存在下的多糖衍生物。6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其特征在于，所述冷冻保护剂是二甲基亚砜(DMSO)和乙二醇的混合物。7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，DMSO/乙二醇比率为50：...

【专利技术属性】
技术研发人员：德尔菲娜·康南，法比安·埃克特斯，皮埃尔·万德泽瓦曼，卢卡·格罗贝，
申请(专利权)人：列日大学，
类型：发明
国别省市：比利时,BE