一种具有低受体结合活性的高致病性H7N9禽流感病毒抗原及其制备方法技术

本发明专利技术公开了一种具有低受体结合活性的高致病性H7N9禽流感病毒抗原及其制备方法，包括以下步骤：制备突变HA基因：制备突变后的高致病性H7N9禽流感病毒全长HA蛋白的基因序列，得到R220G突变HA基因；其中所述R220G突变HA基因序列如SEQ ID NO.2所示；拯救病毒：采用R220G突变HA基因拯救重组流感病毒。该方法制备出的重组高致病性H7N9禽流感病毒，将位于受体结合区域的220位点的精氨酸突变为甘氨酸，降低HA蛋白受体结合亲和力。

A highly pathogenic H7N9 avian influenza virus antigen with low receptor binding activity and its preparation method

【技术实现步骤摘要】
一种具有低受体结合活性的高致病性H7N9禽流感病毒抗原及其制备方法
本专利技术涉及病毒基因工程领域，尤其涉及一种具有低受体结合活性的高致病性H7N9禽流感病毒抗原及其制备方法。
技术介绍
A(甲)型流感病毒(influenzaAvirus)，是正粘病毒科(Orthomyxoviridae)的代表种。根据流感病毒感染的对象，可以将病毒分为人类流感病毒、猪流感病毒、马流感病毒以及禽流感病毒等类群。根据血凝素蛋白(HA蛋白)以及神经氨酸酶(NA)的不同，A型流感病毒可以进一步分为不同的HA亚型(H1-H18)和NA亚型(N1-N11)。当人或动物感染该病毒时可能会引起流感大流行，严重时甚至导致人或动物死亡。2013年3月，一种全球首发的新型H7N9亚型流感病毒在我国长江三角洲地区引发疫情并迅速蔓延，至今仍有散发病例。截至2018年11月，人感染H7N9确诊病例1567例，其中死亡612人，病死率高达39％。H7N9流感病毒在流行过程中，不断地进行变异与进化。HA基因进化成为长江三角洲系和珠江三角洲系；并且内部基因进一步与H9N2禽流感病毒进行重组。2013年至2016年9月的四次H7N9流行中，H7N9人感染病例由且仅由低致病性H7N9禽流感病毒(LPAIH7N9)造成，LPAIH7N9流感病毒感染禽类表现为无症状或轻微症状。而2016年10月开始第五次H7N9流行季，广东省首次从患者体内分离到了高致病性H7N9禽流感病毒(HPAIH7N9流感病毒)，该毒株HA蛋白裂解位点为KRKRTAR/G或KGKRIAR/G基序，与LPAIH7N9毒株HA蛋白裂解位点序列(KGR/G)相比，插入了多个碱性氨基酸。研究显示HPAIH7N9流感病毒不仅对鸡具有高致病力，而且对小鼠、雪貂等哺乳动物也均具有高致病力。因此HPAIH7N9流感病毒更加具有流感大流行的潜在威胁。由于H7N9流感病毒不断变异，因此HPAIH7N9流感病毒的抗原性分析显得尤为重要。血凝抑制(HI)试验广泛用于检测针对流感病毒HA蛋白的中和抗体效价，是WHO推荐的流感病毒疫苗免疫原性评估、血清流行病学研究和流感病毒抗原性分析的有效工具。HI试验是基于流感病毒HA蛋白能够结合红细胞受体、凝集红细胞，检测血清中阻断流感病毒HA蛋白凝集红细胞的抗体效价。因此，HI试验受到两方面因素影响，一方面为流感病毒HA蛋白与红细胞受体的亲和力，另一方面为抗体与流感病毒HA蛋白的结合能力。许多研究表明，当病毒株(例如HPAIH7N9病毒)具有强受体亲和力时，能够更加有效地黏附红细胞，使HI抗体反应显著下降，从而错误地评价HI抗体效价以及病毒抗原性。并且无论同源还是异源H7N9免疫血清HPAIH7N9流感病毒均具有HI反应性低的特点。通过红细胞受体结合实验证明HPAIH7N9流感病毒具有高受体结合能力，然而通过小鼠免疫实验、微量中和(MN)试验和酶联免疫吸附试验(ELISA)等证明HPAIH7N9流感病毒具有良好的免疫原性而且抗原性没有发生明显改变。因此，HPAIH7N9流感病毒HI结果受到高受体结合亲和力的影响，HI试验无法正确地反映针对HPAIH7N9流感病毒的抗体效价，并且错误地评估其抗原性。然而，目前还没有相应的方法能够避免受体亲和力的变化对HI试验结果的影响。
技术实现思路
为了克服现有技术的不足，本专利技术的目的之一在于提供种具有低受体结合活性的HPAIH7N9流感病毒抗原的制备方法，以克服传统HPAIH7N9具有很高的受体结合亲和力，HI试验无法正确地反映针对HPAIH7N9流感病毒的抗体效价，并且错误地评估其抗原性等问题。本专利技术的目的之二在于提供一种具有低受体结合活性的HPAIH7N9流感病毒抗原，以解决HI试验中受体亲和力的变化对结果的影响这一问题。本专利技术的目的之一采用如下技术方案实现：一种具有低受体结合活性的HPAIH7N9流感病毒抗原的制备方法，包括以下步骤：制备突变HA基因：制备突变后的高致病性H7N9禽流感病毒全长HA蛋白的基因序列，得到R220G突变HA基因；其中所述R220G突变HA基因序列如SEQIDNO.2所示；拯救病毒：采用R220G突变HA基因拯救重组流感病毒。进一步地，在制备R220G突变HA基因的步骤中，首先合成高致病性H7N9禽流感病毒全长HA蛋白的基因序列，所述高致病性H7N9禽流感病毒全长HA蛋白的基因序列如SEQIDNO.1所示；通过同源重组将高致病性H7N9禽流感病毒全长HA蛋白的基因序列插入流感病毒反向遗传操作质粒pM中，制得pM-H7/GD16/WT质粒。进一步地，在制备R220G突变HA基因步骤中，设计点突变引物对插入pM质粒的高致病性H7N9禽流感病毒全长HA蛋白的基因序列进行定点突变，制得pM-H7/GD16/R220G质粒；其中，所述点突变引物的序列如SEQIDNO.3及SEQIDNO.4所示。进一步地，在通过同源重组将高致病性H7N9禽流感病毒全长HA蛋白的基因序列插入流感病毒反向遗传操作质粒pM中，制得pM-H7/GD16/WT质粒的步骤中，包括：根据所述高致病性H7N9禽流感病毒全长HA蛋白的基因序列和质粒pM的3’和5’末端设计同源重组引物，其中引物的如SEQIDNO.5及SEQIDNO.6所示。进一步地，在拯救病毒步骤中，将pM-H7/GD16/R220G质粒与PB2重组pM质粒、PB1重组pM质粒、PA重组pM质粒、NP重组pM质粒、NA重组pM质粒、M重组pM质粒及NS重组pM质粒混合，共转染至293T和MDCK共培养细胞中，收集细胞转染上清，制得重组流感病毒。进一步地，所述NA重组pM质粒为pM-N9/GD16质粒，其中pM-N9/GD16质粒中的NA基因的序列如SEQIDNO.7所示。进一步地，共转染12～24h后加入终浓度为0.5～2.5μg/ml的TPCK-trypsin，继续培养后收集细胞转染上清；将上清接种于SPF鸡胚尿囊腔中，孵育、收集鸡胚尿囊液，制得重组流感病毒。进一步地，还包括：制备pM-N9/GD16质粒：合成高致病性H7N9禽流感病毒NA蛋白的基因序列；通过同源重组将高致病性H7N9禽流感病毒NA蛋白的基因序列插入禽流感病毒反向遗传操作质粒pM中，制得pM-N9/GD16质粒。在通过同源重组将高致病性H7N9禽流感病毒NA蛋白的基因序列插入禽流感病毒反向遗传操作质粒pM中，制得pM-N9/GD16质粒的步骤中，包括：进一步地，根据所述高致病性H7N9禽流感病毒全长NA蛋白的基因序列和质粒pM的3’和5’末端设计同源重组引物，其中引物的如SEQIDNO.8及SEQIDNO.9所示。本专利技术的目的之二采用如下技术方案实现：具有低受体结合活性的HPAIH7N9流感病毒抗原，采用任一项所述的具有低受体结合活性的HPAIH7N9流感病毒抗原的制备方法制得。相比现有技术，本专利技术的有益效果在于：(1)本专利技术具有低受体结合活性的HPAIH7N9流感病毒抗原的制备方法制备出的重组HPAIH7N9流感病毒，将位于受体结合区域的220位点的精氨酸(R)突变为甘氨酸(G)，使HA蛋白受体结合亲和力降低，能够使HI试验结果不受高受体结合亲和力的影响。(2)本专利技术具有低受体结合活性的HPAIH7N9流感病本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种具有低受体结合活性的高致病性H7N9禽流感病毒抗原的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：制备突变HA基因：制备突变后的高致病性H7N9禽流感病毒全长HA蛋白的基因序列，得到R220G突变HA基因；其中所述R220G突变HA基因序列如SEQ ID NO.2所示；拯救病毒：采用R220G突变HA基因拯救重组流感病毒。

【技术特征摘要】
1.一种具有低受体结合活性的高致病性H7N9禽流感病毒抗原的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：制备突变HA基因：制备突变后的高致病性H7N9禽流感病毒全长HA蛋白的基因序列，得到R220G突变HA基因；其中所述R220G突变HA基因序列如SEQIDNO.2所示；拯救病毒：采用R220G突变HA基因拯救重组流感病毒。2.根据权利要求1所述的具有低受体结合活性的高致病性H7N9禽流感病毒抗原的制备方法，其特征在于，在制备R220G突变HA基因的步骤中，首先合成高致病性H7N9禽流感病毒全长HA蛋白的基因序列，所述高致病性H7N9禽流感病毒全长HA蛋白的基因序列如SEQIDNO.1所示；通过同源重组将高致病性H7N9禽流感病毒全长HA蛋白的基因序列插入流感病毒反向遗传操作质粒pM中，制得pM-H7/GD16/WT质粒。3.根据权利要求2所述的具有低受体结合活性的高致病性H7N9禽流感病毒抗原的制备方法，其特征在于，在制备R220G突变HA基因步骤中，设计点突变引物对插入pM质粒的高致病性H7N9禽流感病毒全长HA蛋白的基因序列进行定点突变，制得pM-H7/GD16/R220G质粒；其中，所述点突变引物的序列如SEQIDNO.3及SEQIDNO.4所示。4.根据权利要求2所述的具有低受体结合活性的高致病性H7N9禽流感病毒抗原的制备方法，其特征在于，在通过同源重组将高致病性H7N9禽流感病毒全长HA蛋白的基因序列插入流感病毒反向遗传操作质粒pM中，制得pM-H7/GD16/WT质粒的步骤中，包括：根据所述高致病性H7N9禽流感病毒全长HA蛋白的基因序列和质粒pM的3’和5’末端设计同源重组引物，其中引物的如SEQIDNO.5及SEQIDNO.6所示。5.根据权利要求3所述的具有低受体结合活性的高致病性H7N9禽流感病毒抗原的制备方法，其特征在于，在拯救病毒步骤中，将pM-H7/GD16...

【专利技术属性】
技术研发人员：王洋，陈凌，潘蔚绮，吕云华，董记，
申请(专利权)人：广州医科大学，
类型：发明
国别省市：广东,44