海州常山NAC基因CtNAC2及其应用制造技术

本发明专利技术公开了海州常山NAC基因CtNAC2及其应用。本发明专利技术选取两个种源的海州常山，从海州常山组织中克隆得到一个新的NAC基因，命名为CtNAC2，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，表达蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，并通过qRT‑PCR技术对海州常山不同组织中CtNAC2基因表达量及海州常山盐胁迫不同处理时间下叶片中CtNAC2基因表达量进行测定分析，结果表明NAC基因CtNAC2在海州常山的茎和根中的表达较高。在盐胁迫处理下，反应72h时基因表达量最高，参与海州常山茎和根的生长发育和盐胁迫的响应，可用于在植物的抗逆基因工程改良，应用前景广阔。

CtNAC2 Gene of Changshan NAC in Haizhou and Its Application

【技术实现步骤摘要】
海州常山NAC基因CtNAC2及其应用
本专利技术属于基因工程
，具体涉及海州常山NAC基因CtNAC2及其应用。
技术介绍
NAC基因家族广泛分布于植物界各个物种，是植物所特有的最大转录因子家族之一(周鸿慧等，2017)，NAC基因家族有A、B、C、D、E五个亚区，起初在矮牵牛中被发现，之后在其他植物中也发现NAC基因家族(段奥其等，2018)，现已证明NAC基因家族广泛参与植物发育、植物生物和非生物胁迫应答，且可增强植物对胁迫的防御和耐受能力(TakHetal.，2018)，如白桦中BpNAC012可以增强盐胁迫和渗透胁迫耐受性(Huetal.，2018)。海州常山(ClerodendrumtrichotomumThunb.)，又名臭梧桐，为马鞭草科(Verbenaceae)赦桐属(ClerodendrumL.)灌木或小乔木，其花果美丽，是一种夏季观花、冬季观果的优良观赏花木(杨秀莲等，2019)。此外海州常山具有药用功能，其叶、枝干和根均可入药，具有抗高血压、关节炎、风湿和抗炎等作用(胡海军等，2014；etal.，2017)。沿海土壤盐渍化一直是一个世界性问题，选择合适的沿海盐碱植物一直是恢复沿海生态的关键措施(Heetal.，2014；Lietal.，2010)。海州常山对于不良非生物胁迫具有良好抗性，拥有耐盐(岳远征等，2018)、耐水淹(曾德静等，2013)、耐高温(陈燕等，2015)和耐干旱(魏娟等，2009)等优良性状，尤其对盐胁迫有着优良的抗性，是一种可用于恢复沿海盐碱地生态的耐盐植物(李娅等，2017)。海州常山作为优良的耐盐植物，目前关于其在盐胁迫下分子响应机制的研究仍较为缺乏。探明海州常山在盐胁迫下的分子响应机制，对于海州常山在生态恢复上具有十分重要的意义。
技术实现思路
专利技术目的：针对技术的不足，本专利技术的目的是提供海州常山NAC基因CtNAC2，以实现NAC基因在海州常山盐胁迫应答响应机制的进一步研究；本专利技术的另一目的是提供海州常山NAC基因CtNAC2的表达蛋白；本专利技术的再一目的是提供上述基因在提高海州常山盐胁迫耐受性中的应用，所述基因在海州常山的茎和根中的表达较高。在盐胁迫处理下，反应72h时基因表达量最高，参与海州常山茎和根的生长发育和盐胁迫的响应，可用于在植物的抗逆基因工程改良，应用前景广阔。技术方案：为了实现上述专利技术目的，本专利技术采用的技术方案为：海州常山NAC基因CtNAC2，其核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。海州常山NAC基因CtNAC2的表达蛋白，其氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。所述海州常山NAC基因CtNAC2在提高海州常山盐胁迫耐受性中的应用。所述海州常山NAC基因CtNAC2的表达载体。所述海州常山NAC基因CtNAC2的宿主菌。所述海州常山NAC基因CtNAC2克隆引物为：上游引物：5′-CATCGCCATCATCAGCAC-3′；下游引物：5′-CCGCCACATAATCACCG-3′。有益效果：与现有技术相比，本专利技术选取两个种源的海州常山，从海州常山组织中克隆得到一个新的NAC基因，命名为CtNAC2，并通过qRT-PCR技术对海州常山不同组织中CtNAC2基因表达量及海州常山盐胁迫不同处理时间下叶片中CtNAC2基因表达量进行测定分析，结果表明NAC基因CtNAC2在海州常山的茎和根中的表达较高。在盐胁迫处理下，反应72h时基因表达量最高，参与海州常山茎和根的生长发育和盐胁迫的响应，可用于在植物的抗逆基因工程改良，应用前景广阔。附图说明图1是海州常山不同组织中CtNAC2基因表达量图；图2是海州常山盐胁迫不同处理时间下叶片中CtNAC2基因表达量图。具体实施方式下面结合具体实施例进一步说明本专利技术，但这些实例并不用来限制本专利技术。以下实施例所使用的主要供试材料为：采用种植在南京林业大学白马教学研究基地内的泰安、盐城两个海州常山种源。实施例11海州常山组织器官的选取采样时间为2018年9月13日。在天气情况理想条件下，采集海州常山组织样品。选择生长良好、高度和长势较为一致的3棵植株(作为3个生物学重复)进行采样，每株分别采集根、茎、叶、花、果等组织，采集后放入无菌无酶的离心管中，并迅速用液氮速冻带回实验室，置-80℃超低温冰箱保存备用。2胁迫处理材料的准备采集海州常山组织样品时，同时采集两个种源的插穗，将插穗扦插于混合基质(珍珠岩∶蛭石∶泥炭∶沙＝1∶1∶1∶1∶2)中，置于培养室培养(25℃，60％RH)，定期浇灌养护，保证正常生长，待插穗生长出4对以上叶片后使用。所有胁迫处理均在人工气候培养箱中完成(宁波东南仪器厂RDN-1000-3)，待处理前一周将海州常山扦插苗放入每瓶培养基均为150mL的1/4MS培养基中，移入人工气候培养箱中适应一周，设置光照时间为14h，昼夜温度为25/21℃，光照强度为180mmol/m2/s，相对湿度为60％。将插穗置于含1.0％NaCl的培养基中(每瓶均为150mL培养基，参考海州常山耐盐阈值0.8％NaCl浓度确定本实施例所使用的NaCl浓度)，于胁迫0h、2h、6h、12h、24h、48h和72h采集插穗叶片。3海州常山CtNAC2克隆海州常山总RNA提取均采用北京艾德莱生物有限公司的EASYspinPlus试剂盒，提取的RNA先经过用1.5％的琼脂糖凝胶电泳验证RNA的完整性，所有OD260/OD280在1.8～2.0之间，OD260/OD230＞2.0，所有样品中RNA至少2条清晰条带，18S/28S条带大致为2∶1才会被采用。用Mettler公司生产的核酸检测仪UV5NANO检测RNA质量及浓度。使用北京全式金公司的EasyScriptOne-StepgDNARemovalandcDNASynthesisSuperMix反转录试剂盒试剂盒合成cDNA第一条链。根据已有转录组测序数据库获得一条海州常山NAC基因全长，使用primerpremier5.0设计引物，NAC转录因子基因全长克隆正向引物5′至3′端为CATCGCCATCATCAGCAC，反向引物5′至3′端为CCGCCACATAATCACCG，引物设计原则、PCR反应体系及反应程序参照王晰等人的方法(王晰等，2018，http：//kns.cnki.net/kcms/detail/detail.aspx？filename＝NNXB201804021&dbcode＝CJFD&dbname＝CJFD2018&v＝)等，通过切胶回收，将产物连接转化，挑选3个阳性克隆送至南京金斯瑞生物有限公司测序。测序后获得长度为1438bp，如SEQIDNO.1所示，将此序列命名为CtNAC2，编码蛋白为328个氨基酸组成的序列，如SEQIDNO.2所示。4海州常山CtNAC2表达分析使用TaKaRa公司的ExTaqTM染料进行qRT-PCR，荧光定量仪型号为赛默飞公司的pliedBiosystemsStepOnePCRSystem。使用primerpremier5.0设计引物，正向引物5′至3′端为TTCGGGGAGGGAAGTTCAG，反向引物5′至3′端为AGACATCGCCATCATCAGCA，内参选用课题组之前筛选本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.海州常山NAC基因CtNAC2，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

【技术特征摘要】
1.海州常山NAC基因CtNAC2，其核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。2.权利要求1所述的海州常山NAC基因CtNAC2的表达蛋白，其氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。3.权利要求1所述的海州常山NAC基因CtNAC2在提高海州常山盐胁迫耐受性中的应用。4.含有权利要求1所述的海州常山NAC基因CtN...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨秀莲，华雅洁，王良桂，岳远征，施婷婷，胡蝶，丁文杰，
申请(专利权)人：南京林业大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32