一种通过EMS诱变罗布麻产生突变体库的方法技术

本发明专利技术公开了一种通过EMS诱变罗布麻产生突变体库的方法，包括三个步骤，即首先对罗布麻进行选种，然后通过EMS诱变预试验选择合适的EMS浓度，最后根据实验结果对罗布麻EMS诱变突变体库构建。本发明专利技术采用化学诱变剂EMS对罗布麻进行诱变，其EMS诱变剂浓度和诱变时间、方式得到确定，通过该方法可高效的获得罗布麻突变体库，并进行了筛选，获得叶色叶型、株型变异以及高黄酮含量的突变体植株材料，为种质创新、基因功能验证等奠定了良好的基础。

A Method of Generating Mutant Library of Apocynum venetum by EMS Mutagenesis

【技术实现步骤摘要】
一种通过EMS诱变罗布麻产生突变体库的方法
本专利技术涉及一种产生突变体库的方法，具体为一种通过EMS诱变罗布麻产生突变体库的方法。
技术介绍
罗布麻（ApoacynumvenetumL.）又称茶棵子、茶叶花、红柳子、羊肚拉角等，植物学分类属夹竹桃科（Apocynaceae），是一种半灌木状多年生草本宿根植物。1952年由已故农业经济学家董正钧先生首次在新疆罗布泊发现而得名。目前一般认为我国的罗布麻植物可划分为1属2种，即罗布麻属（ApocynumL.），包括罗布红麻（A.venetumL.）和罗布白麻（A.hendersoniiHook.f.）两个种。罗布麻在中国北方盐碱、沙荒地和河滩等地生长，尤其以新疆地区分布和产量最为广泛。罗布麻发现之初，主要用做纺织材料，解决我国当时纺织材料短缺的问题。直到现在，罗布麻也是一种重要的纺织原料，其优质的韧皮纤维素有“野生纤维之王”之称，在纺织工业中仍具有重要的应用。罗布麻具有耐旱、耐寒、耐暑、耐盐碱、耐大风等极强的抗逆性，对改良土壤、保持水土、防风固沙的作用十分显著，是一种理想的绿化植物，生态利用价值十分突出。此外，由于罗布麻的根茎叶中含有丰富的强心苷、黄酮类、三萜类、酚类、有机酸等药用有效成分，因此具有极大的药用价值。罗布麻叶提取物在预防动脉硬化、抗抑郁等方面具有良好的疗效，尤其是在对降血压的治疗上，目前已有罗布麻浸膏、复方罗布麻片等中成药问世。并且，罗布麻做为一种药食同源植物，罗布麻茶、保健饮料等相关产业开发也在蓬勃发展。然而这些工业开发基本上都是以野生罗布麻做为原材料，没有专用型品种，加工材料来源单一对野生资源的过度依赖采伐利用加之整个生态环境日益恶化和中国的城镇化建设快速推进以及农田开辟，成片麻田多已受到破坏而逐渐消失，野生罗布麻的资源数量正在急剧减少。良好的种质资源是进行育种的重要保障，也是解决目前罗布麻产业没有专用型品种的基础。因此我们对此做出改进，提出一种通过EMS诱变罗布麻产生突变体库的方法。
技术实现思路
为解决现有技术存在的目前工商业生产中因无专用型罗布麻品种而大量采集野生资源，造成野生资源破坏和生态环境退化缺陷，本专利技术提供一种通过EMS诱变罗布麻产生突变体库的方法，通过EMS对罗布麻种子进行诱变，建立突变体库，从后代突变体中筛选针对纺织、药用、保健用、观赏用等专用型用途的突变体材料。为了解决上述技术问题，本专利技术提供了如下的技术方案：本专利技术一种通过EMS诱变罗布麻产生突变体库的方法，包括三个步骤，即首先对罗布麻进行选种，然后通过EMS诱变预试验选择合适的EMS浓度，最后根据实验结果对罗布麻EMS诱变突变体库构建；选种选择经过脱粒后清除杂质且剔除不饱满的罗布麻种子；EMS诱变预试验步骤为：步骤一：取12个50mL离心管，然后在每个离心管中加入30mLddH2O；然后称取罗布麻种子1.5g加入ddH2O中，保持质量体积比为1:20；在28℃条件下220r/min，45°夹角摇动处理24h，让种子充分吸胀，12h时换一次ddH2O；步骤二：再用水配制含有0.5%、0.7%和0.9%的EMS溶液，EMS诱变预试验步骤一的离心管24h后倒出ddH2O，然后加入30mL三种不同浓度的EMS溶液至罗布麻种子离心管中，每个浓度处理3管，余下的3管用30mLddH2O做为对照，按照EMS诱变预试验步骤一的方法进行摇动13h；步骤三：处理完成后，离心管中倒掉EMS溶液，用ddH2O充分冲洗处理过的种子；步骤四：冲洗完成后，将种子倒在滤纸上，过夜晾干；步骤五：在培养皿中铺上滤纸，并湿透水，每个培养皿中点70粒EMS诱变预试验步骤四处理过的种子做萌发实验；步骤六：定期统计不同EMS浓度处理种子的萌发率和最终的成苗率，选择成苗率接近50%的EMS浓度进行批量处理，前7天统计萌发率，以露白为标准，第10天时统计成苗率；罗布麻EMS诱变突变体库构建步骤如下：步骤一：根据EMS诱变预试验的结果，选用0.7%的EMS进行批量处理罗布麻种子，种子预先按照EMS诱变预试验步骤一的方法进行吸胀处理，然后按照EMS诱变预试验步骤二的方法进行诱变处理，为了达到构建10000个突变体的规模，处理种子约20000粒；步骤二：种子处理完晾干后（此时处理完的种子属于M1代），按粒点播在育种苗盘中，进行常规管理；步骤三：罗布麻种子苗当年不能开花结实，由种子长成的植株2-3年才能收种，为了鉴定EMS诱变的效果，在M1代幼苗中调查显性突变性状，对性状明显发生改变的植株单独编号，幼苗长大后移栽到大田中，正常田间管理，保存突变体，其它播种的突变体材料也同时移栽管理；步骤四：育苗盘中突变体植株长到6周时，取长势基本一致的突变体和对照材料相同叶位的叶子进行总黄酮含量的检测；步骤五：F3H是罗布麻黄酮生物合成途径中的一个关键合成酶基因，为了检测EMS在分子层面的诱变效果，取突变体和对照植株的叶片提取DNA，然后扩增F3H基因，最后对基因进行测序。作为本专利技术的一种优选技术方案，所述罗布麻种子选择直径在4.5m-5.5m之间的罗布麻群落里采集的种子。作为本专利技术的一种优选技术方案，所述EMS诱变预试验步骤一中1.5g罗布麻种子约3000粒。作为本专利技术的一种优选技术方案，所述EMS诱变预试验步骤三用ddH2O充分冲洗10次处理过的种子。作为本专利技术的一种优选技术方案，所述EMS诱变预试验步骤五的萌发实验培养皿置于培养间或培养箱中，设置温度条件24±2℃，光周期14/10（光/暗）。本专利技术的有益效果是：该种通过EMS诱变罗布麻产生突变体库的方法，采用化学诱变剂EMS对罗布麻进行诱变，其EMS诱变剂浓度和诱变时间、方式得到确定，通过该方法可高效的的获得罗布麻突变体库，并进行了筛选，获得叶色叶型、株型变异以及高黄酮含量的突变体植株材料，为种质创新、基因功能验证等奠定了良好的基础。附图说明附图用来提供对本专利技术的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本专利技术的实施例一起用于解释本专利技术，并不构成对本专利技术的限制。在附图中：图1是本专利技术不同浓度EMS处理罗布麻种子萌发图片；图2是罗布麻不同类型突变体图片；图3是罗布麻突变体总黄酮含量图；图4是突变体F3H基因突变碱基检测。具体实施方式以下结合附图对本专利技术的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本专利技术，并不用于限定本专利技术。实施例：如图1、图2、图3和图4所示，本专利技术一种通过EMS诱变罗布麻产生突变体库的方法，包括三个步骤，即首先对罗布麻进行选种，然后通过EMS诱变预试验选择合适的EMS浓度，最后根据实验结果对罗布麻EMS诱变突变体库构建；选种选择经过脱粒后清除杂质且剔除不饱满的罗布麻种子；EMS诱变预试验步骤为：步骤一：在50mL离心管中加入30mLddH2O；然后称取罗布麻种子1.5g加入ddH2O中，保持质量体积比为1:20；在28℃条件下220r/min，45°夹角摇动处理24h，让种子充分吸胀，12h时换一次ddH2O。预实验处理12管。步骤二：用水配制含有0.5%、0.7%和0.9%的EMS溶液，24h后倒出离心管中的ddH2O，然后加入30mL三种不同浓度的EMS溶液至罗布麻种子离心管中，每个浓度处理3管，余下的3管用30mLddH2O做为对本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种通过EMS诱变罗布麻产生突变体库的方法，其特征在于，包括三个步骤，即首先对罗布麻进行选种，然后通过EMS诱变预试验选择合适的EMS浓度，最后根据实验结果对罗布麻EMS诱变突变体库构建；选种选择经过脱粒后清除杂质且剔除不饱满的罗布麻种子；EMS诱变预试验步骤为：步骤一：取12个50 mL离心管，然后在每个离心管中加入30 mL ddH2O；然后称取罗布麻种子1.5 g加入ddH2O中，保持质量体积比为1:20；在28℃条件下220 r/min ，45°夹角摇动处理24 h，让种子充分吸胀，12 h时换一次ddH2O；步骤二：再用水配制含有0.5%、0.7%和0.9%的EMS溶液，EMS诱变预试验步骤一的离心管24 h后倒出ddH2O，然后加入30 mL三种不同浓度的EMS溶液至罗布麻种子离心管中，每个浓度处理3管，余下的3管用30 mL ddH2O做为对照，按照EMS诱变预试验步骤一的方法进行摇动13 h；步骤三：处理完成后，离心管中倒掉EMS溶液，用ddH2O充分冲洗处理过的种子，冲洗10次；步骤四：冲洗完成后，将种子倒在滤纸上，过夜晾干；步骤五：在培养皿中铺上滤纸，并湿透水，每个培养皿中点70粒EMS诱变预试验步骤四处理过的种子做萌发实验；步骤六：定期统计不同EMS浓度处理种子的萌发率和最终的成苗率，选择成苗率接近50%的EMS浓度进行批量处理，前7天统计萌发率，以露白为标准，第10天时统计成苗率；罗布麻EMS诱变突变体库构建步骤如下：步骤一：根据EMS诱变预试验的结果，选用0.7%的EMS进行批量处理罗布麻种子，种子预先按照EMS诱变预试验步骤一的方法进行吸胀处理，然后按照EMS诱变预试验步骤二的方法进行诱变处理，为了达到构建10000个突变体的规模，处理种子约20000粒；步骤二：种子处理完晾干后（此时处理完的种子属于M1代），按粒点播在育种苗盘中，进行常规管理；步骤三：罗布麻种子苗当年不能开花结实，由种子长成的植株2‑3年才能收种，为了鉴定EMS诱变的效果，在M1代幼苗中调查显性突变性状，对性状明显发生改变的植株单独编号，幼苗长大后移栽到大田中，正常田间管理，保存突变体，其它播种的突变体材料也同时移栽管理；步骤四：育苗盘中突变体植株长到6周时，取长势基本一致的突变体和对照材料相同叶位的叶子进行总黄酮含量的检测；步骤五：F3H是罗布麻黄酮生物合成途径中的一个关键合成酶基因，为了检测EMS在分子层面的诱变效果，取突变体和对照植株的叶片提取DNA，然后扩增F3H基因，最后对基因进行测序。...

【技术特征摘要】
1.一种通过EMS诱变罗布麻产生突变体库的方法，其特征在于，包括三个步骤，即首先对罗布麻进行选种，然后通过EMS诱变预试验选择合适的EMS浓度，最后根据实验结果对罗布麻EMS诱变突变体库构建；选种选择经过脱粒后清除杂质且剔除不饱满的罗布麻种子；EMS诱变预试验步骤为：步骤一：取12个50mL离心管，然后在每个离心管中加入30mLddH2O；然后称取罗布麻种子1.5g加入ddH2O中，保持质量体积比为1:20；在28℃条件下220r/min，45°夹角摇动处理24h，让种子充分吸胀，12h时换一次ddH2O；步骤二：再用水配制含有0.5%、0.7%和0.9%的EMS溶液，EMS诱变预试验步骤一的离心管24h后倒出ddH2O，然后加入30mL三种不同浓度的EMS溶液至罗布麻种子离心管中，每个浓度处理3管，余下的3管用30mLddH2O做为对照，按照EMS诱变预试验步骤一的方法进行摇动13h；步骤三：处理完成后，离心管中倒掉EMS溶液，用ddH2O充分冲洗处理过的种子，冲洗10次；步骤四：冲洗完成后，将种子倒在滤纸上，过夜晾干；步骤五：在培养皿中铺上滤纸，并湿透水，每个培养皿中点70粒EMS诱变预试验步骤四处理过的种子做萌发实验；步骤六：定期统计不同EMS浓度处理种子的萌发率和最终的成苗率，选择成苗率接近50%的EMS浓度进行批量处理，前7天统计萌发率，以露白为标准，第10天时统计成苗率；罗布麻EMS诱变突变体库构建步骤如下：步骤一：根据EMS诱变预试验的结果，选用0.7%的EMS进行批量处理罗布麻种子，种子预先按照EMS诱变预试验步骤一的方法进行吸胀处...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐宗昌，高婷，任宏伟，任婷婷，杜海娜，李义强，张成省，王萌，孟晨，马斯琦，
申请(专利权)人：中国农业科学院烟草研究所，青岛农业大学，
类型：发明
国别省市：山东,37