一种胞外AA9家族多糖单加氧酶EpLPMOa及其应用制造技术

本发明专利技术提供了一种胞外AA9家族多糖单加氧酶EpLPMOa及其应用，该胞外AA9家族多糖单加氧酶EpLPMOa基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明专利技术的EpLPMOa具有广泛的底物特异性，可氧化作用于纤维素、木葡聚糖等多种底物，对其糖苷键进行C1/C4位氧化切割产生C1和C4混合氧化产物。该酶与木霉纤维素酶协同作用，可分别将木霉纤维素酶在降解磷酸膨涨纤维素、滤纸和脱木质素麦秆等还原糖产量最高提高45％、108％和34％，而对木葡聚糖混合的磷酸膨涨纤维素、滤纸和脱木质素麦秆等还原糖产量最高提高81％，121％，和56％，显示该酶在木质纤维生物炼制中具有重要应用前景。

An Extracellular AA9 Polysaccharide Monooxygenase EpLPMOa and Its Application

【技术实现步骤摘要】
一种胞外AA9家族多糖单加氧酶EpLPMOa及其应用
本专利技术属于生酶工程领域，尤其是涉及一种胞外AA9家族多糖单加氧酶EpLPMOa及其应用。
技术介绍
由纤维素、半纤维和木质素等多聚物组成的木质纤维是地球上含量最丰富的可再生生物质资源，如何通过生物炼制技术将木质纤维制备为生物基能源和化学品是当今生物技术研究的热点。基于生物法的木质纤维生物炼制主要包括预处理、酶解和发酵等个过程，传统酶解是利用纤维素酶、半纤维素酶等糖苷水解酶将纤维素、半纤维素水解为可发酵的还原糖的过程，但是，由于木质纤维中纤维素分子之间的氢键以及它和其他二种多聚物相互交联组成复杂的网状结构，大大降低了纤维素酶和半纤维素酶的作用效率，导致酶解成本很高，成为限制木质纤维生物炼制工业化应用的关键因素。AA9家族裂解性多糖单加氧酶(LPMO)是近年来发现的一种以氧化方式降解纤维素、半纤维素等多糖糖苷键的新型辅助蛋白。它和纤维素酶、半纤维素酶等糖苷水解酶存在高效的协同作用，因此添加外源的裂解性多糖单加氧酶可以极大地提高木质纤维的酶解效率。目前，已报道的AA9的来源仍然有限，挖掘新的来源的AA9家族多糖单加氧酶对AA9的研究以及提高木质纤维素的酶解效率有很重要的意义。
技术实现思路
专利技术目的：针对现有技术存在的不足，本专利技术的目的是提供一种胞外AA9家族多糖单加氧酶EpLPMOa，满足降解纤维素和/或木质纤维素的使用需求。本专利技术的另一目的是提供一种上述胞外AA9家族多糖单加氧酶EpLPMOa的应用。技术方案：为达到上述目的，本专利技术的技术方案如下：一种胞外AA9家族多糖单加氧酶EpLPMOa，其氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。编码所述的胞外AA9家族多糖单加氧酶EpLPMOa的基因，其核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。所述胞外AA9家族多糖单加氧酶EpLPMOa来自于微细正青霉Eupenicilliumparvum4-14。用于表达所述的胞外AA9家族多糖单加氧酶EpLPMOa的载体或宿主菌。所述的胞外AA9家族多糖单加氧酶EpLPMOa的表达方法，采用TrichodermareeseiTrCel61A的信号肽来实现EpPMOa在酵母的高效分泌。所述的胞外AA9家族多糖单加氧酶EpLPMOa的表达载体的构建方法，步骤如下：S1：采用TrichodermareeseiTrCel61A的信号肽序列取代pPICZαA中alpha信号肽序列；S2：以PMOa_f1/PMOa_r1为引物，以cDNA为模板通过PCR扩增得到目的基因片段，并将该基因克隆到载体pEASY-Blunt中得到pEASY-EpLPMOa；再以pEASY-EpLPMOa为模板和引物PMOa_f2和PMOa_r2，通过PCR扩增N-端和C-端分别含部分TrCel61A的信号肽序列和6xHis标签的EpLPMOa基因片段，割胶纯化，后通过试剂盒HieffCloneTMOneStepCloningKit，同源重组到pPICZ-TrS载体中获得表达载体pPICZ-EpLPMOa；引物PMOa_f1和PMOa_r1序列分别为：5’-TACCTCCACTGCGAACAACA-3’，5’-AGCCAGCCAGCTATACATCAT-3’；引物PMOa_f2和PMOa_r2序列分别为：5’-TTGCTACTGGTGTTGTGGGACATGGCTACGTCTCCAGCAT-3’，5’-AGATGAGTTTTTGTtctagaTCAGTGATGGTGATGGTGATGGTGACCGCTATACAGCGC-3’。步骤S1的具体方法为：含TrCe161A信号肽序列的DNA片段通过互补引物pTrS_f和pTrS_r退火合成，再用限制性核酸内切酶BstBI和EcoRI酶切，连接到同样经过BstBI和EcoRI酶切pPICZαA载体中获得载体pPICZ-TrS；其中，引物pTrS_f和pTrS_r序列分别为：5’-cgaaATGATTCAAAAATTGTCTAACTTACTTGTTACTGCTTTGGCAGTTGCTACTGGTGTTGTGGGAg-3’，5’-aattcTCCCACAACACCAGTAGCAACTGCCAAAGCAGTAACAAGTAAGTTAGACAATTTTTGAATCATtt-3’。采用构建的表达载体pPICZ-EpLPMOa表达胞外AA9家族多糖单加氧酶EpPMOa的方法，包括如下步骤：S1：表达载体pPICZ-EpLPMOa先经限制性核酸内切酶SacI线性化，得到线性酶切产物；S2：以毕赤酵母KM71H为宿主菌，将步骤S1得到的线性酶切产物转入，经过抗性筛选阳性克隆子，获得重组毕赤酵母工程菌株KM71H-pPICZ-EpLPMOa，诱导表达胞外AA9家族多糖单加氧酶EpLPMOa。所述的胞外AA9家族多糖单加氧酶EpLPMOa在降解纤维素和/或木质纤维素中的应用。所述的应用，胞外AA9家族多糖单加氧酶EpLPMOa与纤维素酶系协同降解纤维素和/或木质纤维素。微细正青霉Eupenicilliumparvum4-14(保藏号CCTCCM2015404)是由申请人实验室筛选获得的高效木质纤维降解真菌(CN104988077B)，通过转录组分析首次克隆一种新的编码AA9家族多糖单加氧酶的基因(EpLPMOa)，通过其编码的蛋白功能研究，发现它具有氧化降解纤维素和半纤维素的能力，可以显著提高纤维素酶对复杂木质纤维素的酶解效率，因此具有重要研究和应用价值。有益效果：相对于现有技术，本专利技术的胞外AA9家族多糖单加氧酶EpLPMOa及其应用具有以下优势：1)EpLPMOa与来自里氏木霉的商品纤维素酶协同作用，提高对磷酸润涨纤维素、滤纸和脱木质素麦秆的降解效果，分别可以将商品纤维素酶降解磷酸润涨纤维素、滤纸和脱木质素麦秆的还原糖产量提高45％，27％，22％(对磷酸润涨纤维素)，108％，76％，33％(对滤纸)，18％，34％，31％(对脱木质素麦秆)，当商品纤维素酶的用量为0.1U-0.5U(对磷酸膨涨纤维素)，0.5U-2U(对滤纸)，和1U-3U(对脱木质素麦秆)，表明该酶在生物能源和生物基化学品工业中具有很大的应用潜力和经济效益。2)EpLPMOa与来自里氏木霉的商品纤维素酶协同作用，还可以提高对被木葡聚糖包裹的磷酸润涨纤维素、滤纸和脱木质素麦秆的降解效果，对应的还原糖产量提高量为81％，36％，20％(对磷酸膨涨纤维素)，121％，60％，35％(对滤纸)，56％，30％，41％(对脱木质素麦秆)。附图说明图1是纯化后EpLPMOa蛋白的SDS-PAGE分析结果图；图中，泳道1，纯化后的EpLPMOa；泳道2，EndoHf对EpLPMOa的去糖基化(70kDa)；M，蛋白marker；图2是酶解产物的HPAEC-PAD分析结果图；图3是多糖单加氧酶EpLPMOa水解磷酸润膨涨纤维素、滤纸和脱木质素麦秆得到的还原糖产量分析结果图；图4是多糖单加氧酶EpLPMOa水解被木葡聚糖包裹的磷酸膨涨纤维素、滤纸和脱木质素麦秆得到的还原糖产量分析结果图。具体实施方式下面结合实施例及附图来详细说明本专利技术。除有定义外，以下实施例中所用的技术术语具有与本专利技术所属领域技术人员普遍理解的相同含义。以下实施本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种胞外AA9家族多糖单加氧酶EpLPMOa，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

【技术特征摘要】
1.一种胞外AA9家族多糖单加氧酶EpLPMOa，其氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。2.编码权利要求1所述的胞外AA9家族多糖单加氧酶EpLPMOa的基因，其核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。3.根据权利要求1所述的胞外AA9家族多糖单加氧酶EpLPMOa，其特征在于：所述胞外AA9家族多糖单加氧酶EpLPMOa来自于微细正青霉Eupenicilliumparvum4-14。4.用于表达权利要求1所述的胞外AA9家族多糖单加氧酶EpLPMOa的载体或宿主菌。5.权利要求1所述的胞外AA9家族多糖单加氧酶EpLPMOa的表达方法，其特征在于：采用TrichodermareeseiTrCel61A的信号肽来实现EpLPMOa在酵母的高效分泌。6.权利要求1所述的胞外AA9家族多糖单加氧酶EpLPMOa的表达载体的构建方法，其特征在于，步骤如下：S1：采用TrichodermareeseiTrCel61A的信号肽序列取代pPICZαA中alpha信号肽序列；S2：以PMOa_f1/PMOa_r1为引物，以cDNA为模板通过PCR扩增得到目的基因片段，并将该基因克隆到载体pEASY-Blunt中得到pEASY-EpLPMOa；再以pEASY-EpLPMOa为模板和引物PMOa_f2和PMOa_r2，通过PCR扩增N-端和C-端分别含部分TrCel61A的信号肽序列和6xHis标签的EpPMOa基因片段，割胶纯化，后通过试剂盒HieffCloneTMOneStepCloningKit，同源重组到pPICZ-TrS载体中获得表达载体pPICZ-EpLPMOa；引物PMOa_f1和PMOa_r1序列分别为：5’-TACCTCCACTGCGAACAACA-3’5’-AGCCAGCCAGCTATACATCAT...

【专利技术属性】
技术研发人员：丁少军，时玥欣，陈凯翔，
申请(专利权)人：南京林业大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32