新型宿主细胞及使用了其的目标蛋白质的制造方法技术

本发明专利技术所要解决的课题在于提供使宿主细胞的甲醇同化能力降低、且使目标蛋白质的生产率提高的新型方式。根据本发明专利技术，可以提供通过将本发明专利技术所述的基因失活而使甲醇同化能力降低的宿主细胞、提高了目标蛋白质的生产率的宿主细胞、以及用于将该基因失活的载体，从而解决上述课题。另外，本发明专利技术提供将该宿主细胞用作宿主的目标蛋白质的制造方法。

New Host Cells and the Method of Making Target Proteins Using them

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】新型宿主细胞及使用了其的目标蛋白质的制造方法
本专利技术涉及通过使特定的基因失活而使甲醇同化能力降低的新型宿主细胞、目标蛋白质的生产率得到提高的新型宿主细胞、用于使该基因失活的载体、使用了该新型宿主细胞的目标蛋白质的制造方法。
技术介绍
在医疗和诊断用途中充分利用的抗体、酶和细胞因子等工业上有用的生物材料的生产中广泛使用了基因重组法。作为用于利用基因重组法来生产目标蛋白质的宿主，使用了鸡等动物、CHO等动物细胞、蚕等昆虫、sf9等昆虫细胞、以及酵母、大肠杆菌和放线菌等微生物。在宿主生物中，酵母能够用廉价的培养基进行大规模且高密度地进行培养，因此能够以低成本生产目标蛋白质；如果利用信号肽等，则能够分泌表达至培养液中，因此也使目标蛋白质的纯化过程变得容易；以及，由于酵母为真核生物，因此也能够进行糖链添加等翻译后修饰，由以上可知是非常有益的，进行了各种研究。如果能够开发出可以与酵母中各种目标蛋白质对应的创新性的生产技术，则不仅使生产率大幅提高而带来成本竞争力增强，还可期待广泛的工业应用。作为酵母之一的Komagataellapastoris的蛋白质表达能力优异，是能够充分利用工业生产上有利的廉价碳源的甲醇同化性(Mut+)酵母。例如，非专利文献1中报道了使用Komagataellapastoris来生产绿色荧光蛋白、人血清白蛋白、乙肝病毒表面抗原、人胰岛素和单链抗体等异源蛋白质的方法。在酵母中生产异源蛋白质时，为了提高其生产率，进行了信号序列的添加、强启动子的利用、密码子修饰、伴侣基因的共表达、转录因子基因的共表达、来自于宿主酵母的蛋白酶基因的失活、以及培养条件的研究等各种尝试。例如，专利文献1中报道了通过使用Komagataellapastoris表达激活甲醇诱导性启动子的转录因子来提高生产率。但是，在大规模且高密度培养系统中，使用甲醇作为碳源进行目标蛋白质的生产时存在各种各样的问题。其问题有：甲醇贮藏罐的大型化所带来的安全性风险；因甲醇的氧化而产生的过氧化氢导致的细胞的应激、细胞死亡；因甲醇的燃烧而产生热；大量供给用于保持高密度培养的氧；等。为了解决这些问题，例如非专利文献2～4中记载了使用因AOX1基因破坏引起的甲醇同化能力降低(MutS)的株的目标蛋白质的生产方法。现有技术文献专利文献专利文献1：国际公开第2012/102171号非专利文献非专利文献1：FEMSMicrobiologyReviews24(2000)45-66.非专利文献2：EnzymeandMicrobialTechnology21(1997)277-283.非专利文献3：MicrobialCellFactories(2012)11:22.非专利文献4：BiotechnologyandBioprocessEngineering(2015)20:315-323.
技术实现思路
专利技术要解决的问题然而，在使用非专利文献2～4中记载的甲醇同化能力降低(MutS)株来生产目标蛋白质时，存在培养时间的长期化、碳源的枯竭、由蛋白酶导致目标蛋白质分解这样新的问题。本专利技术的课题在于提供使甲醇同化能力降低、且使目标蛋白质的生产率提高的新型方式。用于解决问题的方法本专利技术人等通过对Komagataella属酵母的染色体DNA的碱基序列进行综合性分析，鉴定了新型蛋白质。然后发现，通过使编码该新型蛋白质的基因失活，宿主细胞的甲醇同化能力降低。而且，还发现目标蛋白质的生产率提高，进而发现通过使激活甲醇诱导性启动子的转录因子高表达，目标蛋白质的生产率进一步提高，从而完成了本专利技术。即，本专利技术包括以下的方式。(1)一种宿主细胞，其是以下(a)～(d)中的任意基因失活了的宿主细胞：(a)包含序列号34所示的碱基序列的基因、(b)包含与由和序列号34所示的碱基序列互补的碱基序列组成的核酸在严格条件下进行杂交的核酸的碱基序列的基因、(c)包含与序列号34所示的碱基序列具有85％以上的序列同源性的碱基序列的基因、(d)编码与序列号33所示的氨基酸序列具有85％以上的序列同源性的氨基酸序列的基因。(2)根据(1)所述的宿主细胞，其是通过载体进行转化而得到的，所述载体含有：与所述(a)～(d)中的任意基因具有同源区域的碱基序列、与所述(a)～(d)中的任意基因的启动子具有同源区域的碱基序列、和/或与所述(a)～(d)中的任意基因的终止子具有同源区域的碱基序列。(3)根据(2)所述的宿主细胞，其中，所述载体含有编码目标蛋白质的碱基序列。(4)根据(2)所述的宿主细胞，其还包含含有编码目标蛋白质的碱基序列的载体。(5)根据(1)～(4)中任一项所述的宿主细胞，与亲本细胞相比，其甲醇同化能力降低。(6)根据(1)～(5)中任一项所述的宿主细胞，其是通过利用包含以下(e)～(h)中的任意碱基序列的载体进行转化而得到的：(e)编码序列号30所示的氨基酸序列的碱基序列、(f)编码在所述(e)所示的氨基酸序列中取代、缺失、和/或添加了1个或多个氨基酸而成的氨基酸序列的碱基序列、(g)编码与所述(e)所示的氨基酸序列具有85％以上的序列同源性的氨基酸序列的碱基序列、或者(h)与由和编码所述(e)所示的氨基酸序列的碱基序列互补的碱基序列组成的核酸在严格条件下进行杂交的核酸的碱基序列。(7)根据(6)所述的宿主细胞，其为酵母、细菌、真菌、昆虫细胞、动物细胞或植物细胞。(8)根据(7)所述的宿主细胞，其中，酵母为甲醇同化性酵母、裂殖酵母或芽殖酵母。(9)根据(8)所述的宿主细胞，其中，甲醇同化性酵母为Komagataella属酵母或Ogataea属酵母。(10)一种目标蛋白质的制造方法，该方法包括：培养(3)～(9)中任一项所述的细胞的工序、以及从培养液回收目标蛋白质的工序。(11)根据(10)所述的方法，其中，目标蛋白质为异源蛋白质。(12)根据(10)或(11)所述的方法，其中，在培养工序中使用包含选自葡萄糖、甘油及甲醇中的一种以上碳源的培养液。本说明书包括作为本申请的优先权基础的日本专利申请号2016-243198号的公开内容。专利技术的效果根据本专利技术，能够降低宿主细胞的甲醇同化能力。另外，根据本专利技术，可以提供目标蛋白质的高效率的生产方法。具体实施方式以下，使用优选的实施方式对本专利技术进行详细说明。在一个方式中，本专利技术涉及一种宿主细胞，其是以下(a)～(d)中的任意基因失活了的宿主细胞：(a)包含序列号34所示的碱基序列的基因、(b)包含与由和序列号34所示的碱基序列互补的碱基序列组成的核酸在严格条件下进行杂交的核酸的碱基序列的基因、(c)包含与序列号34所示的碱基序列具有85％以上的序列同源性的碱基序列的基因、(d)编码与序列号33所示的氨基酸序列具有85％以上的序列同源性的氨基酸序列的基因。在本专利技术中，2个核酸在严格条件下进行杂交例如是指以下的含义。例如，使用固定有核酸X的过滤器，在0.7～1.0M的NaCl存在下、于65℃下与序列同源性为85％以上的核酸Y进行了杂交，然后使用2倍浓度的SSC溶液(1倍浓度的SSC溶液的组成由150mM氯化钠、15mM柠檬酸钠组成)在65℃的条件下清洗过滤器，由此，能够以结合在过滤器上的核酸的形式获得核酸Y，在该情况下，可以将核酸Y称为“与核酸X在严格条件下本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种宿主细胞，其是以下(a)～(d)中的任意基因失活了的宿主细胞：(a)包含序列号34所示的碱基序列的基因、(b)包含与由和序列号34所示的碱基序列互补的碱基序列组成的核酸在严格条件下进行杂交的核酸的碱基序列的基因、(c)包含与序列号34所示的碱基序列具有85％以上的序列同源性的碱基序列的基因、(d)编码与序列号33所示的氨基酸序列具有85％以上的序列同源性的氨基酸序列的基因。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2016.12.15 JP 2016-2431981.一种宿主细胞，其是以下(a)～(d)中的任意基因失活了的宿主细胞：(a)包含序列号34所示的碱基序列的基因、(b)包含与由和序列号34所示的碱基序列互补的碱基序列组成的核酸在严格条件下进行杂交的核酸的碱基序列的基因、(c)包含与序列号34所示的碱基序列具有85％以上的序列同源性的碱基序列的基因、(d)编码与序列号33所示的氨基酸序列具有85％以上的序列同源性的氨基酸序列的基因。2.根据权利要求1所述的宿主细胞，其是通过载体进行转化而得到的，所述载体含有：与所述(a)～(d)中的任意基因具有同源区域的碱基序列、与所述(a)～(d)中的任意基因的启动子具有同源区域的碱基序列、和/或与所述(a)～(d)中的任意基因的终止子具有同源区域的碱基序列。3.根据权利要求2所述的宿主细胞，其中，所述载体含有编码目标蛋白质的碱基序列。4.根据权利要求2所述的宿主细胞，其还包含含有编码目标蛋白质的碱基序列的载体。5.根据权利要求1～4中任一项所述的宿主细胞，与亲本细胞相比，其甲醇同化能力降低。6.根据权利要求1～5中任一...

【专利技术属性】
技术研发人员：西辉之，
申请(专利权)人：株式会社钟化，
类型：发明
国别省市：日本,JP